Новый ботулинический токсин, потенциальная биоэквивалентность препарата онаботулинумтоксинa: существуют ли различия между препаратами?

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ (загрузить статтю)

Авторы: GI-HYEOK YANG, PHD и HYUN HO JUNG, PHD*

Ботулоксины относятся к группе белков, в которую входят семь различных серотипов (A-G), продуцируемых различными штаммами бактерий Clostridium botulinum, природными анаэробными эубактериями, образующими эндоспоры.1 Существует более шести продуктов ботулотоксина, доступных на рынке: онаботулинумтоксинA (БОТОКС, “Аллерган, Инк.” (Allergan Inc.), Ирвайн, Калифорния), BTXA (Институт биологических продуктов Ланьчжоу, Китай), абоботулинумтоксинA (Диспорт, “Ипсен Лимитед” (Ipsen Limited.), Рексем, Великобритания), римаботулинумтоксинB (Нейроблок, “Сольстис Ньюросайнсез” (Solstice Neurosciences), Луисвілл, Кентукки), Нейронокс (nue-BoNT/A “Медитокс, Инк.” (Medytox Inc.), Чхонвон, Корея) и инкоботулинумтоксинA (Ксеомін, “Мерц Фармасьютикалз” (Merz Pharmaceuticals), Франкфурт-на-Майне, Германия).

Эти препараты можно разделить на три группы в зависимости от их серотипа и молекулярной природы: токсины серотипа А (онаботулинумтоксинA, абоботутулинумтоксинA, BTXA и neu-BoNT/A), токсины, не содержащие серотипа А (инкоботулинумтоксинА), и токсины серотипа B ( таблица 1).2-7

Из перечисленных препаратов онаботулинумтоксин является наиболее широко известным и преобладает на рынке ботулинических токсинов, поскольку он впервые был одобрен и выведен на рынок в США в 1989 году. АбботулинумтоксинА занимает второе место на рынке токсинов и продается в Европе, Азии, Латинской Америке и в Соединенных Штатах, поскольку Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) приняло его использование для лечения цервикальной дистонии и сильно выраженных глабелярных морщин. Впервые инкоботулинумтоксин был представлен на рынке в Германии в 2005 году и стал доступным в США. Сравниваемость этих продуктов, особенно препаратов онаботулинумтоксинА и абоботутулинумтоксинА, является предметом споров за последние два десятилетия, главным образом из-за различных характеристик, таких как молекулярная масса, вспомогательное вещество и показатели эффективности. Хотя то, каким образом эти различия могут повлиять на клиническую эффективность и безопасность препаратов, все еще остается предметом дискуссий, было общепризнано, что эти два препарата ботулотоксина не взаимозаменяемы.

С начала Neu-BoNT/A был разработан с целью получения характеристик, близких к характеристикам препарата онаботулинумтоксинA. Как и в случае многих других биоподобных препаратов, цель разработки заключалась в создании надежной альтернативы, позволяющей снизить стоимость лечения и которую врачи могли бы легко использовать, не путая дозировку и не беспокоясь о безопасности. После более чем 6 лет исследований, в частности на разработке программ по сохранению сопоставимости препаратов, neu-BoNT/A был принят для лечения блефароспазма в Южной Корее в 2006 году. Он стал одним из самых популярных продуктов ботулотоксина, доступных в странах Азии и Латинской Америки, таких как Южная Корея, Япония, Таиланд и Бразилия для лечения и в косметических целях.

В статье рассматриваются научные данные о сопоставимости препаратов онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A.

Сравнение микробиологических, физико-химических и биохимических профилей: ОнаботулинумтоксинА и neu-BoNT/A

Учитывая, что ботулотоксин является биологическим агентом, который образуется в живых клетках, следует тщательно рассмотреть происхождение штаммов бактерий. Компания “Медитокс Инк.” использует Clostridium botulinum тип А штамм Hall, то есть тот же штамм, что и компания “Аллерган”. Были проанализированы результаты секвенирования ДНК комплекса токсина типа А, в том числе все нетоксичные компоненты, а также сам токсин (номер доступа GeneBank DQ409059). Выведенная аминокислотная последовательность препарата neu-BoNT/A согласовывалась с данными компании “Аллерган”, опубликованными в 2003 г.,8 и отличий между аминокислотными последовательностями двух препаратов найдено не было (данные не приведены). Следовательно, препараты, производимые компанией “Аллерган” из C. botulinum типа A Hall (AF488749, 488748, 488747, AF488746, AF488745) и “Медитокс” (DQ409059), по существу происходят от того же штамта. типа A.

Ботулотоксин, производимый с использованием бактерии C. botulinum, представляет собой очищенную культуральную жидкость. Поскольку методы, применяемые для культивирования и очистки, являются конфиденциальной информацией производителей, публикации по ним отсутствуют. Поэтому невозможно непосредственно сравнить производственные процессы, но молекулярная масса комплекса токсина конечного балк-материала, на который повлияют такие процессы, была в центре дискуссий в течение последних двух десятилетий, продолжавшихся вокруг темы сравнения различных препаратов. Некоторые утверждают, что онаботулинумтоксин А является однородным комплексом токсина 900 кДа, тогда как абоботулинумтоксин А представляет собой смесь комплексов 500 и 900 кДа. Такие отличия в молекулярной массе могут быть причиной разницы в моделях диффузии или распространения в ткани вокруг места инъекции.10,11

Хотя последствия различных молекулярных масс противоречивы, а клиническое значение молекулярной массы неясно, было принято решение о разработке гомогенного комплекса токсинов 900 кДа. Поскольку в одном флаконе коммерческого препарата ботулинового токсина содержится лишь несколько нанограмм комплекса токсина (примерно в 10000 раз большим количеством сывороточного альбумина человека), изъять комплекс токсинов из флаконов невозможно. Таким образом, структуру этих продуктов невозможно напрямую сравнить. В то же время был проведен анализ препарата neu-BoNT/A с использованием высокоэффективной вытеснительной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) со смесью стандартов молекулярной массы, в результате чего был получен единичный пик на хроматограмме, отражающий его однородность (рис.1). Молекулярная масса комплекса токсина была определена по сравнению с калибровочной кривой, построенной на основе показателей. Средняя молекулярная масса 10 партий балк-материала составляла 904±7 кДа, что приближается к молекулярной массе комплекса токсина балк-материала. Эти данные получила группа исследователей компании “Аллерган”: 880 кДа по результатам SE-HPLC и 925±45 кДа по результатам анализа светорассеяния.

До сих пор не установлено, значительно ли коррелирует молекулярная масса комплекса токсина с нежелательной диффузией или распространением препарата ботулотоксина.

Впрочем, с теоретической точки зрения можно было бы утверждать, что поскольку онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A сходны по размерам молекулы, их диффузные структуры тоже сходны.

Несмотря на различный состав препаратов ботулотоксина, сывороточный альбумин человека (HSA) используется в качестве вспомогательного вещества во всех препаратах, за исключением китайского BTXA, в котором вместо альбумина используется желатин (таблица 1). Флакон neu-BoNT/A 100-U, как и флакон онаботулинумтоксинA 100-U, содержит 100 ЕД очищенного токсинного комплекса, 0,9 мг хлорида натрия и 0,5 мг HSA. Абоботулинумтоксин A имеет меньшее содержание HSA (0,125 мг) и содержит 2,5 мг лактозы во флаконе 500 ЕД (упаковка Диспорт). (В Соединенных Штатах или ботулинумтоксин A доступен во флаконе по 300 ЕД). Инкоботулинумтоксин A содержит 1,0 мг HSA и 5 мг сахарозы во флаконе по 100 ЕД. Состав препарата римаботулинумтоксин также отличается от других: 0,5 мг HSA, 5,844 мг хлорида натрия и 1,621 мг сукцината натрия13 (упаковка Нейроблок). Несмотря на то, что до сих пор неясно, могут ли различные вспомогательные вещества влиять на клинические результаты, существуют определенные данные, указывающие на возможное влияние сывороточного альбумина человека на биологическую доступность ботулотоксина.14 Поскольку препарат neu-BoNT/A имеет такой же состав, что и онаботулинумтоксинA, разницы в действии вспомогательных веществ этих препаратов не существовало бы.

Рисунок 1. Хроматограмма, полученная в результате высокоэффективной вытеснительной жидкостной хроматографии для очищенного комплекса ботулотоксина типа А, выполненной с использованием эксклюзивной колонки Shodex Protein KW-804 (внутренний диаметр 8,0 мм х длина 300 мм, размер частиц 300 мм). Элюированный образец прошел контроль при поглощении ультрафиолета с длиной волны 278 нм.

Приведенные выше доказательства позволяют предположить, что действие препарата neu-BoNT/A будет клинически сходным с действием препарата онаботулинумтоксинA, поскольку он имеет тот же штамм C. botulinum, аналогичный размер комплекса токсина и одинаковые ингредиенты во флаконе.

Доклинические данные по сопоставимости, полученные на основе фармакодинамических моделей

Перед обсуждением возможности клинического использования neu-BoNT/A необходимо рассмотреть другие вопросы. Основным вопросом является эффективность препарата neu-BoNT/A. Одна единица ботулотоксина обычно соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) при внутрибрюшинном введении мышей. Прямое сравнительное исследование нескольких партий онаботулинумтоксин A и эталонных партий neu-BoNT/A, проведенное путем количественного определения действующего вещества в условиях in vivo свидетельствует о том, что в условиях in vivo активность двух препаратов практически одинакова (таблица 2). Однако поскольку методы проведения анализа у каждого производителя разные (тип среды-носителя, схема разведения, лабораторные протоколы), сравнить биологическую активность единиц достаточно трудно, не говоря уже о перерасчете доз.15,16 Таким образом было проведено несколько фармакодинамических исследований для сравнения биологической активности двух указанных выше препаратов.

Для оценки фармакологической активности ботулинических токсинов в нервно-мышечном синапсе используются несколько методов исследования на животной модели. Первый метод определения суммарного потенциала мышечного действия (CMAP) представляет собой электрофизиологическое определение функции мышц. Микротоки, генерируемые при сокращении мышц, усиливаются и регистрируются, и таким образом позволяют количественно определить степень угнетения высвобождения ацетилхолина в нервно-мышечном соединении.17,18 DAS, пальцевый отвод), модифицированный Аоки и коллегами,19,20 представляет собой вербальную шкалу, используемую для оценки степени очаговой слабости в результате химической денервации, вызванной введением токсина в заднюю конечность. В данной модели доклинических исследований коэффициенты безопасности могут быть рассчитаны на основе соотношения между средней эффективной дозой (ЭД50; степень фокального ослабления) и ЛД50 (системная диффузия после внутримышечного введения токсина). Третий метод, модель генерации мышечной силы, включающая исследование функций задней конечности крыс, может использоваться для оценки многих параметров, в частности для уменьшения генерации мышечной силы и потенциальной диффузии токсина в контралатеральную конечность. Все три описанные выше модели позволяют оценить длительность действия препаратов и время восстановления.

Взаимосвязь доза-ответ для препаратов онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A в части ингибирования мышечного усилия впервые была продемонстрирована на модельных мышах, а время восстановления определялось на основе паралича мышц, вызванного действием токсина. Действие указанных препаратов привело к эквивалентным ответам.21 Недавно было завершено сравнительное исследование препаратов neu-BoNT/A, онаботулинумтоксин A, абоботулинумтоксинA и инкоботулинумтоксинA с использованием метода CMAP на модельных мышах. Коэффициент пересчета доз для препаратов онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A составил 1:1 (Чанг М.Э., личное сообщение). Был также проведен сравнительный анализ препаратов онаботулинумтоксинA, абоботулинумтоксинA и neu-BoNT/A с применением модели DAS (С.Б. Kim и др., стендовый доклад, представленный на конференции “Токсины 2008”, Бавено, Италия). Согласно предварительным исследованиям, все параметры, включая ЭД50, ЛД50 и коэффициент безопасности оказались сопоставимыми, что свидетельствует о сходстве препаратов онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A, по крайней мере, на стадии доклинических испытаний на животных.

Были проведены семь независимых экспериментов с использованием трех различных партий ботокса и neu-BoNT/A. * Для измерения биологической активности препаратов применяли количественное определение действующего вещества на основе расчета летальной дозы для мышей на предприятии “Медитокс”. (1 ЕД = 1 средняя летальная доза для мышей).

Сравнительные клинические исследования

Исходя из имеющихся на сегодняшний день данных, можно утверждать, что 1 ЕД препарата онаботулинумтоксинА соответствует 2-5 ЕД препарата илиболутулинумтоксинА. чем онаботулинумтоксинА.20,26

Поскольку neu-BoNT/A был недавно представлен на рынке, на сегодняшний день нет достаточного количества результатов исследований, освещенных в литературе. Двойное слепое рандомизированное сравнительное исследование препаратов “Нейронокс” (отечественная торговая марка neu-BoNT/A) и онаботулинумтоксинA при лечении эссенциального блефароспазма 27 позволило прийти к выводу, что между двумя группами пациентов не было определено существенных отличий относительно эффективности. век, функций зрения) или безопасности при коэффициенте пересчета дозы 1:1. Другое рандомизированное двойное слепое лацебо-контролируемое многоцентровое клиническое исследование, в ходе которого сравнивалось действие репаратов онаботулинумтоксинA и neu-BoNT/A, показало, что препарат neu-BoNT/A так же эффективен и безопасен, как и онаботулинумтоксинA при лечении спастично ДЦП.28 Двойное слепое рандомизированное сравнительное исследование эффективности лечения глабелярных морщин также продемонстрировало сопоставимую эффективность и безопасность препаратов neu-BoNT/A и онаботулинумтоксинA при коэффициенте пересчета дозы 1:1, что согласуется с результатами исследований на животных (Ц.Г. Вон Неопубликованные данные).

Выводы

На мировом рынке представлено более пяти препаратов ботулотоксина типа А. ОнаботулинумтоксинA, абоботулинумтоксин A и инкоботулинумтоксинA были приняты Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов для использования в терапевтических и косметических целях. Несмотря на необходимость проведения более масштабных исследований по безопасности при длительном использовании препаратов и дополнительных сравнительных клинических исследований по применению в различных целях, препарат neu-BoNT/A кажется похожим на препарат онаботулинумтоксинA в соответствии с результатами предыдущих исследований в нескольких различных областях (офтальмология, неврология и эстетическая медицина). Поэтому можно ожидать, что эти препараты будут конкурировать на рынках, где они представлены.

Ссылки

1. Oguma K, Fujinaga Y, Inoue K. Clostridium botulinum toxin. Toxin Rev 1997;16(4):253–66.

2. Jankovic J, Vuong KD, Ahsan J. Comparison of efficacy and immunogenicity of original versus current botulinum toxin in cervical dystonia. Neurology 2003;60(7):1186–8.

3. Setler P. The biochemistry of botulinum toxin type B. Neurology 2000;55(12 Suppl 5):S22–8.

4. Dressler D, Benecke R. Xeomin®: perspektiven einer neuen therapeutischen Botulinumtoxinpr€aparation. Aktuelle Neurologie 2006;33(3):138–41.

5. Dressler D. Complete secondary botulinum toxin therapy failure in blepharospasm. J Neurol 2000;247(10):809–10.

6. Carruthers A, Carruthers J. Botulinum toxin products overview. Skin Therapy Lett 2008;13(6):1–4.

7. Pickett A, Panjwani N, O’Keeffe R. Potency of type A botulinum toxin preparaions in clinical use. 40th annual meeting of the interagency botulinum research coordinating committee (IBRCC). Atlanta, USA; 2003.

8. Zhang L, Lin W-J, Li S, Aoki KR. Complete DNA sequences of the botulinum neurotoxin complex of Clostridium botulinum type A-Hall (Allergan) strain. Gene 2003;315:21–32.

9. Wenzel R, Jones D, Borrego JA. Comparing two botulinum toxin type A formulations using manufacturers’ product summaries. J Clin Pharm Ther 2007;32(4):387–402.

10. Frevert J, Dressler D. Complexing proteins in botulinum toxin type A drugs: a help or a hindrance? Biologics 2010;4:325–32.

11. Trindade de Almeida AR, Marques E, De Almeida J, Cunha T, et al. Pilot study comparing the diffusion of two formulations of botulinum toxin type A in patients with forehead hyperhidrosis. Dermatol Surg 2007 ;33(1 Spec No.):S37–43.

12. Lietzow MA, Gielow ET, Le D, Zhang J, et al. Subunit stoichiometry of the Clostridium botulinum type A neurotoxin complex determined using denaturing capillary electrophoresis. Protein J 2008;27(7–8):420–5.

13. Xeomin (SPC) Drugs.com [Internet]. Available from: http://www.drugs.com/uk/xeomin-spc-8243.ht ml cited June 28, 2011.

14. Bigalke H, Wohlfarth K, Irmer A, Dengler R. Botulinum A toxin: Dysport improvement of biological availability. Exp Neurol 2001;168(1):162–70.

15. Sesardic D, Leung T, Gaines Das R. Role for standards in assays of botulinum toxins: international collaborative study of three preparations of botulinum type A toxin. Biologicals 2003;31 (4):265–76.

16. Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD. Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 1994;128(1):69–77.

17. Sakamoto T, Torii Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of the biological activity of botulinum toxin type A by measuring the compound muscle action potential (CMAP) in rats. Toxicon 2009;54(6):857–61.

18. Torii Y, Goto Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of biological activity of botulinum toxins utilizing compound muscle action potentials (CMAP), and comparison of neuromuscular transmission blockage and muscle flaccidity among toxins. Toxicon 2010;3:407–14.

19. Aoki KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon 2001;39 (12):1815–20.

20. Aoki KR. Botulinum neurotoxin serotypes A and B preparations have different safety margins in preclinical models of muscle weakening efficacy and systemic safety. Toxicon 2002;40(7): 923–928.

21. Stone AV, Ma J, Whitlock PW, Koman LA, et al. Effects of Botox and Neuronox on muscle force generation in mice. J Orthop Res 2007;25(12):1658–64.

22. Brashear A. Clinical comparisons of botulinum neurotoxin formulations. Neurologist 2008;14(5):289–98.

23. Sampaio C, Costa J, Ferreira JJ. Clinical comparability of marketed formulations of botulinum toxin. Mov Disord 2004;19 (Suppl 8):S129–36.

24. Jost WH, Kohl A, Brinkmann S, Comes G. Efficacy and tolerability of a botulinum toxin type A free of complexing proteins (NT 201) compared with commercially available botulinum toxin type A (BOTOX) in healthy volunteers. J Neural Transm 2005;112(7):905–13.

25. Hunt T, Clarke K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin Neuropharmacol 2009;32(1):28–31.

26. Wohlfarth K, M€uller C, Sassin I, Comes G, et al. Neurophysiological double-blind trial of a botulinum neurotoxin type a free of complexing proteins. Clin Neuropharmacol 2007;30(2):86–94.

27. Yoon JS, Kim JC, Lee SY. Double-blind, randomized, comparative study of Meditoxin versus Botox in the treatment of essential blepharospasm. Korean J Ophthal 2009;23(3):137–41.

28. Kim K, Shin H-I, Kwon BS, Kim SJ, et al. Neuronox versus BOTOX for spastic equinus gait in children with cerebral palsy: a randomized, double-blinded, controlled multicentre clinical trial. Dev Med Child Neurol 2011;53(3):239–44.

Address correspondence and reprint requests to: Gi-Hyeok Yang, PhD, Microbial Toxin R&D Center, Ochang Science Industry Complex 641–4, Gak-ri, Ochang-eup, Cheongwon-gun, Chungbuk 366–883, Korea, or e-mail: yanggh@medy-tox.co.kr