Сравнительное исследование биологической активности четырех препаратов ботулотоксина типа А в эксперименте на мышах
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ (загрузить статью)
Авторы: MYUNG EUN CHUNG, MD, PHD;* DAE HEON SONG, MD, PHD;* AND JOOH YUN PARK, MD, PHD †
РЕЗЮМЕ Исследуемые препараты ботулотоксина не взаимозаменяемы, и коэффициент пересчета дозы для этих препаратов остается противоречивым.
ЦЕЛЬ Сравнение эффективности и безопасности четырех препаратов ботулотоксина типа А.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Суммарные потенциалы действия икроножных мышц (CMAP) в мышах были зарегистрированы до и после инъекции четырех препаратов ботулотоксина (онаботулинумтоксинA, или боботулинумтоксинA, новый ботулинический токсин и инкоботулинумтоксинA).
РЕЗУЛЬТАТЫ Для всех препаратов после введения амплитуды CMAP уменьшались в течение 4 дней, а затем постепенно восстанавливались. На 84-й день после инъекции амплитуды возвращались к исходным значениям во всех группах, кроме групп, получавших высокие дозы. Амплитуда CMAP в контралатеральной конечности также уменьшалась в течение 4-7 дней после инъекции, а затем постепенно возвращалась к исходному уровню до 28 дня.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Был определен коэффициент конверсии доз для препаратов онаботулинумтоксинА и абоботутулинумтоксинА, который составлял 1:2,6; коэффициент 1:3, указанный в предварительных выводах, признан завышенным. Коэффициент пересчета доз препарата онаботулинумтоксинА и нового ботулинического токсина 1:1 был признан целесообразным. Для препаратов онаботулинумтоксинА и инкоботулинумтоксинА коэффициент перерасчета составлял 1:1,07. Эффективность препарата инкоботулинумтоксинА была несколько ниже действия препарата онаботулинумтоксинА. Эти коэффициенты конверсии используются только для расчета эффективной, а не безопасной дозы. Это исследование проводилось на мышах, поэтому его результаты не могут быть в полной мере применимы в медицинских целях.
Спонсором исследования выступила компания “Медитокс Инк.” (Medytox Inc.), Корея
Ботулотоксин типа А – это токсин, производимый анаэробными бактериями Clostridium botulinum, и представляющий собой белковый комплекс молекулярной массой 900 кДа в своем естественном состоянии. Комплекс состоит из нейротоксических компонентов, нетоксичных белков и гемагглютинина весом 150 кДа.1 Его клиническое применение началось в 1970-х годах, и с тех пор сфера его применения расширилась, включив случаи дистонии (блефароспазм и цервикальной дистонии), мышечной гипергидроза, мигрени и для усиления действия анестетиков.2,3
В препараты ботулотоксина типа А, доступные в продаже, входят онаботулинумтоксинA (OboNT) (БОТОКС, “Аллерган, Инк.” (Allergan Inc.), Ирвайн, Калифорния), абоботулинумтоксин A (ABoNT) (Диспорт “Ипсен Лимитед” (Ipsen Limited.), Рексем, Великобритания),нкоботулинумтоксинA (IBoNT), (Ксеомин, “Мерц” (Merz), Франкфурт-на- Майни, Германия и нейронокс (NBoNT) (“Медитокс, Инк.” (Medytox Inc.), Чхонвон, Южная Корея). Молекулярная масса препарата OBoNT составляет 900 кДа, поскольку представляет собой сочетание нейротоксических компонентов и комплексообразующих белков массой 150 кДа. Молекулярная масса ABoNT составляет 500-900 кДа, а NBoNT – 900 кДа. В отличие от других препаратов ботулотоксина типа А, IBoNT имеет молекулярную массу 150 кДа, поскольку состоит только из нейротоксических компонентов. Эти препараты имеют разную эффективность и уровень безопасности благодаря своему уникальному биологическому происхождению, а по коэффициенту пересчета доз препаратов ведутся дискуссии.5,6
Сообщается, что коэффициент пересчета доз препаратов OBoNT и ABoNT варьируется от 1:1 до 1:6, но в новых публикациях коэффициент 1:4 и больше не одобряется. , Стоун и его коллеги сообщили, что NBoNT и OBoNT обладали одинаковыми показателями эффективности. .3,4,10,11 Постоянный коэффициент пересчета для препаратов трудно применять, поэтому во время лечения имели место непредвиденные побочные эффекты, возникшие в результате применения различных препаратов ботулинового токсина типа А. Например, когда при исследовании эффективности лечения цервикальной дистонии применяли препараты OBoNT и ABoNT с коэффициентом 1:3, в группе OBoNT частота дисфагии была выше, чем в группе ABoNT.12
Для оценки биологической активности ботулотоксина типа А используются разные методы. Определение средней летальной дозы (ЛД50) у мышей при введении интраперитонеально (ИП) – это количественный метод, который применяют после введения токсина в брюшную полость мышей. Дополнительными количественными методами являются измерение активности эндопептидазы in vitro посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и количественные тесты in vivo, состоящие из анализа воздействия на нервно-мышечную передачу (DAS – digit abduction scoring).13,14 испытание ex vivo, например, использование диафрагмального нерва – купола диафрагмы мышей. Из методов, приведенных выше, метод ЛД50 путем ИП менее эффективен, поскольку он не оценивает влияние токсина на угнетение нервно-мышечной передачи, а позволяет оценить летальность через паралич дыхательных мышц.15,16 Кроме того, для точной оценки требуется больше данных.17 Метод ИФА, с помощью которого измеряется активность эндопептидазы, проводится без использования животных (и, следовательно, экономически выгоднее), но он менее точен, чем биологический опыт на мышах.14 Метод с использованием диафрагмального нерва мышей является точным, но требует определенных технических навыков, а также не предполагает возможности воспроизводимости.18,19 В ходе DAS-анализа используется шкала оценки, но иногда трудно различить между собой два полученных результата, а сами результаты представляют собой дискретные данные.
Биологическую активность ботулотоксина можно оценить путем определения суммарного потенциала мышечного действия (CMAP), посредством которого оценивается подавленность нервно-мышечной передачи.20 CMAP, представляющий собой усиленный и зарегистрированный электрический импульс, возникающий при сокращении мышц, может численно выражать степень угнетения нервно-мышечной передачи. Проведен ряд клинических испытаний с целью анализа эффективности ботулотоксина путем получения CMAP в коротких разгибателях пальцев человека. В ряде экспериментов на испытуемых животных оценивали эффективность действия ботулотоксина путем определения CMAP.3,5,7,11,15,16,20,21
Таким образом, нами была проведена оценка и сравнение эффективности, а также расчет коэффициентов пересчета дозы четырех доступных в продаже препаратов ботулотоксина типа А путем определения CMAP.
Материалы и методы
Животные
Самки мышей ICR/CD-1 (в возрасте 8 недель, весом примерно 30 г каждая) были приобретены у компании “Ориент Био, Инк.” (Orient Bio, Inc.) (Сандевон, Соннам, Южная Корея), распределенные по группам по семь человек, содержались при 12-часовом цикле света-темноты со свободным доступом к пище и воде. Комитет по использованию подопытных животных Медицинского колледжа Католического университета Кореи утвердил протокол.
Приготовление и введение токсина
Организатор слепого эксперимента, не участвовавший в определении CMAP или DAS-анализе, подготовил четыре препарата ботулотоксина типа А, доступные на рынке. Каждый токсин был восстановлен и разведен в 5 мкл физраствора. Триста ЕД ABoNT было принято за эквивалент 100 ЕД других токсических препаратов для упрощения сравнения. В целях обезболивания мышам было сделано ИП инъекции кетамина гидрохлорида в объеме 0,25 мг. Заднюю конечность брили и вводили 5 мкл разбавленного токсина в икроножную мышцу после инъекции наркоза с помощью шприца Гамильтон 26-G (“Гамильтон Компани” (Hamilton Company), Рино, Невада) в следующих дозах: 0,0; 0,3; 1,0; 3,3; 10,0; 33,3; 100,0 ЕД/кг для групп OBoNT, NBoNT и IBoNT, а также 0,0; 1,0; 3,0; 10,0; 30,0; 100,0; 300,0 ЕД/кг для группы ABoNT. Каждая группа состояла из семи мышей, которым вводили дозу препарата.
Зарегистрированные значения CMAP
Определение CMAP осуществлялось с использованием электромиографа Николет Вайкинг Квест (Nicolet Viking Quest) (Вайасис Хелскеа (Viasys Healthcare), Мэдисон, Висконсин). Мышам вводили обезболивающее и фиксировали их в положении лежа. Перед определением CMAP место ввода электрода сбрили. Температура на поверхности кожи поддерживалась на уровне 32-36°C посредством нагревательной лампы и нагревательной плиты. Измерения температуры на поверхности кожи производились с помощью бесконтактного инфракрасного термометра (PT-3S, “ОПТЕКС” (OPTEX), Токио, Япония) в месте ввода измерительного электрода. Для стимуляции игольчатые электроды из нержавеющей стали размером 1 см размещали подкожно во всю длину иглы. Анод вводился поперек тела мыши в средней части, а кончик игольчатого электрода был введен на расстоянии 1 мм от основания хвоста по направлению к хвосту. Катод был введен на 3 мм сбоку от анода. 1-сантиметровую подкожную иглу вводили в бедро той же конечности в качестве электрода заземления, а в качестве измерительного электрода использовали 6-миллиметровый золотой ушной чашечный электрод с зажимом. Измерительный электрод размещался на широкой части икроножной мышцы, а контрольный – на сухожилии. Интенсивность постепенно увеличивали до получения постоянного максимального значения амплитуды CMAP без возникновения артефактов. Сила тока при формировании большинства электрических раздражителей составляла 10-40 мА продолжительностью 0,1 мс. Настройка фильтра – 2-10000 Гц. CMAP мышей измеряли до (0) и через 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 70 и 84 дня после инъекций ботулотоксина А.
DAS-анализ
Сравнение четырех препаратов ботулотоксина типа А производилось с помощью анализа DAS с целью определения эффективности.
После инъекций ботулинического токсина наблюдатель, которому был неизвестен тип используемого препарата, оценивал разные степени воздействия на нервно-мышечную передачу по 5-балльной шкале разведения пальцев (0 = стопа расслаблена, пальцы разведены, как и на конечности, в которую нет было введено препарат; 1 = стопа расслаблена, пальцы сведены больше, чем на конечности, в которую не было введено препарат, или два пальца сведены, а остальные полностью разведены; одного;3 = пять пальцев сведены, но стопа расслаблена, или четыре пальца сведены, а стопа изогнута; 4 = стопа изогнута, все пять пальцев сведены). , 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 и 56 дней после инъекции.
Статистический анализ
Получены средние значения и стандартные отклонения CMAP амплитуд, а также степень отклонения (в процентах) от исходного уровня. Был выполнен односторонний дисперсионный анализ для каждой дозы для сравнения эффективности четырех различных препаратов, а также применен критерий Дункана в качестве ретроспективного анализа. Для анализа использовали показатели CMAP, полученные в день, когда каждый препарат должен дать максимальный эффект для расчета средней эффективной дозы по показателям CMAP (ЕД50) и токсической дозы по показателям CMAP (ТД20). ЕД50 по показателям CMAP определяли как дозу, что приводит к 50% уменьшению амплитуды CMAP по сравнению с исходными значениями в месте введения препарата. ТД20 по показателям CMAP определяли как уменьшение значения амплитуды CMAP на 20% по сравнению с исходными значениями, полученными на месте, противоположном месту инъекции. ЭД50 и ТД20 по показателям CMAP определялись с помощью пробит-анализа. Метод SAS 9.1 (“Институт САС, Инк.” (SAS Institute, Inc.), Кэри, Северная Каролина) использовался для статистического анализа и p<.05 был принят за уровень статистической значимости.
Результаты
Изменения амплитуды CMAP в зависимости от времени в икроножной мышце после введения препарата
Амплитуда CMAP была установлена с целью проведения электрофизиологической количественной оценки эффектов хемоденервации после интрамускульного введения ботулотоксина. Для всех препаратов амплитуда CMAP снижалась в зависимости от дозы. Максимальное понижение наблюдалось примерно на 4 день, после чего амплитуда CMAP начинала постепенно восстанавливаться. К 84-му дню после инъекции значение амплитуды вернулось к исходному уровню для всех групп, кроме групп 33,3 ЕД/кг для OBoNT, NboNT или IBoNT и группы 100 ЕД/кг для ABoNT (рис. 1). В группах с наиболее высокими дозами (OBoNT, NBoNT, IBoNT: 100 ЕД/кг, ABoNT: 300 Ед/кг) все животные погибли через 2-4 дня после инъекции, за исключением группы IBoNT 100 ЕД/кг, в которой четыре из семи мышей остались живы до конца исследования.
Изменения амплитуды CMAP со временем в икроножных мышцах противоположной конечности, в которую не был введен препарат.
Амплитуда CMAP в икроножной мышце левой конечности была определена для выявления эффектов диффузии на противоположную сторону. Уменьшение амплитуды CMAP в зависимости от дозы отмечалось для всех препаратов ботулотоксина типа А. Не наблюдалось уменьшения амплитуды CMAP при дозе 3,3 ЕД/кг или менее для OBoNT, NBoNT или IBoNT или при 10 ЕД/кг или меньше для ABoNT. Для доз 10 ЕД/кг или более для OBoNT, NBoNT или IBoNT и 30 ЕД/кг или выше для ABoNT амплитуда CMAP уменьшалась в течение 4-7 дней после инъекции, а затем постепенно восстанавливалась. На 28 день после инъекции амплитуда возвращалась к исходному уровню для всех препаратов токсинов (рис. 2).
Сравнение эффективности по значениям амплитуд CMAP
Для сравнения эффективности четырех препаратов было определено уменьшение амплитуды CMAP в процентах от исходного значения амплитуды CMAP на 4-й день после инъекции (табл. 1). При дозе 3,3 ЕД/кг препаратов OBoNT, NboNT и IBoNT, а также 10 ЕД/кг препарата ABoNT, CMAP составлял 11,3±4,6% для OBoNT, 4,0±1,8% для ABoNT, 4, 8±1,5% для NBoNT и 17,3±6,6% для IBoNT. Наблюдалось гораздо большее уменьшение амплитуды CMAP для NBoNT и ABoNT, чем для OBoNT, и значительно большее уменьшение амплитуды CMAP для OBoNT, чем IBoNT (p < .001). При дозе 10 ЕД/кг препаратов OBoNT, NBoNT и IBoNT, а также 30 ЕД/кг препарата ABoNT CMAP составлял 1,4±0,8% для OBoNT, 0,7±0,1% для ABoNT, 1,4±0 ,6% для NBoNT и 3,6±3,1% для IBoNT. Уменьшение амплитуды CMAP было одинаковым для препаратов OBoNT, AboNT и NBoNT, но все три препарата токсинов вызывали значительно большее уменьшение амплитуды CMAP, чем IBoNT (p=.02). Кроме того, ЭД50 по показателям CMAP, которая определялась как доза препарата токсина, уменьшающая амплитуду CMAP на 50% после инъекции, была рассчитана для пикового эффекта при каждой дозе (табл. 2). ЕД50 по показателям CMAP составляла 0,50 ЕД/кг для OBoNT и NBoNT, но была несколько выше для IBoNT (0,53 ЕД/кг) и ABoNT (1,30 ЕД/кг). Эффективность препаратов, рассчитанная на основе ED50 по показателям CMAP, была аналогична OBoNT и NBoNT. Для IBoNT это значение было несколько ниже, чем для других двух препаратов, а для ABoNT – несколько выше, чем для OBoNT, при коэффициенте 1:3. Коэффициент пересчета дозы для OBoNT и NBoNT составил 1:1, для OBoNT и ABoNT составил 1:2,6, а для OBoNT и IBoNT составил 1:1,07.
ТД20 по значению CMAP и индекс безопасности для препаратов ботулотоксина типа А
Для сравнения эффекта диффузии токсинов на противоположную сторону для каждого препарата ботулотоксина типа А было рассчитано ТД20 по показателям CMAP, являющейся дозой, вызывающей 20% уменьшение амплитуды CMAP в икроножных мышцах левой конечности (таблица 2). ТД20 по показателям CMAP составляла 99,0 ЕД/кг для ABoNT, 65,2 ЕД/кг для IBoNT, 54,9 ЕД/кг для NBoNT и 45,0 ЕД/кг для OBoNT. Индекс безопасности, полученный делением ТД 20 по показателям CMAP на значение ЭД50 по показателям CMAP, составлял 122,0 для IBoNT, 110,33 для NBoNT, 88,6 для OBoNT и 75,5 для ABoNT (таблица 2).
Сравнение показателей эффективности посредством анализа DAS
Все препараты вызывали увеличение интенсивности и периода мышечной слабости в зависимости от дозы в ходе DAS-анализа (рис. 3). Был рассчитан ED50 по показателям DAS, которая была определена как доза, приводящая к результату 2 по шкале DAS после инъекции от момента пик-эффекта при каждой дозе (таблица 3). Для определения системного действия ботулотоксинов была рассчитана доза ЛД50 по показателям DAS при внутримышечном введении, которая определяется как доза, приводящая к гибели 50% мышей после введения токсина (таблица 3). Препарат NBoNT имел самую низкую ЭД50 (7,1 ЕД/кг) по шкале DAS, существенно не отличающейся от показателя OBoNT (8,2 ЕД/кг).
Рис. 2. Изменения в амплитуде суммарного мышечного потенциала (CMAP) в зависимости от времени при применении различных препаратов ботулотоксина типа А, регистрируемых в противоположной конечности, в которую не был введен препарат. Амплитуду CMAP измеряли от исходного уровня до пика в икроножных мышцах левых конечностей всех мышей до и через 1, 2, 4,7, 14, 21, 28,35, 42, 49, 56,70 и 84 дня после инъекции . Каждая точка представляет собой среднее ± стандартное отклонение, n =7. : 0,3 ЕД/кг (1,0 ЕД/кг для препарата абоботулинумтоксинA (ABoNT)), : 1,0 ЕД/кг (3,0 ЕД/кг для ABoNT), : 3,3 ЕД/кг (10, 0 ЕД/кг для ABoNT), : 10,0 Ед/кг (30,0 ЕД/кг для ABoNT), : 33,3 ЕД/кг (100,0 ЕД/кг для ABoNT), : 100,0 ЕД/ кг (300,0 ЕД/кг для ABoNT).
Рис. 1. Изменения в амплитуде суммарного мышечного потенциала (CMAP) в зависимости от времени применения различных препаратов
ботулотоксина типа А, регистрируемые в противоположной конечности, в которую не был введен препарат. Амплитуду CMAP измеряли от
исходного уровня до пика в икроножных мышцах левых конечностей всех мышей до и через 1, 2, 4,7, 14, 21, 28,35, 42, 49, 56,70 и 84 дня после
инъекции. Каждая точка представляет собой среднее ± стандартное отклонение, n =7. : 0,3 ЕД/кг (1,0 ЕД/кг для препарата
абоботулинумтоксинA (ABoNT)) : 1,0 ЕД/кг (3,0 ЕД/кг для ABoNT), : 3,3 ЕД/кг (10,0 ЕД/кг для ABoNT), : 10,0 Ед/кг ( 30,0 ЕД/кг
для ABoNT), : 33,3 ЕД/кг (100,0 ЕД/кг для ABoNT), : 100,0 ЕД/кг (300,0 ЕД/кг для ABoNT).
ЕД50 по показателям DAS для препарата IBoNT составлял 11,6 ЕД/кг, т.е. эффективность была несколько меньше, чем для NBoNT и OBoNT. ABoNT имел самую низкую эффективность (20,9 ЕД/кг), но при индексе пересчета дозы 1:3 его эффективность была несколько выше, чем у препарата OBoNT. Определение ЛД50 по показателям DAS при внутримышечном введении IBoNT было невозможно, поскольку летальность составляла <50% при максимальной дозе 100 ЕД/кг. ЛД50 по показателям DAS при внутримышечном введении составляла 59,7 ЕД/кг для OBoNT и NBoNT и 179,1 ЕД/кг для ABoNT. Значительные различия между препаратами по индексам безопасности не установлены (7,2 для OBoNT, 8,4 для NBoNT и 8,6 для ABoNT).
Обсуждение
Препараты ботулотоксина типа А, имеющиеся на рынке, отличаются методами очистки и химическим составом, что вызывает беспокойство относительно различных показателей эффективности и свойств.
При сравнении препаратов OBoNT и ABoNT по показателям CMAP в процентном выражении в месте инъекции на 4 день после введения препарата показатель эффективности ABoNT был значительно выше при использовании коэффициента пересчета доз 1:3; (3,3 ЕД/кг OBoNT против 10 ЕД/кг ABoNT и 10 ЕД/кг OBoNT против 30 ЕД/кг AboNT). После сравнения ЭД50 по показателям CMAP этих двух препаратов был определен коэффициент пересчета дозы 1:2,6, что согласуется с данными о том, что коэффициент 1:3 был слишком высоким. Недавние исследования с использованием DAS-анализа, проведенного в ходе эксперимента на крысах, данные электромиографии лобных мышц и антигидротическое действие свидетельствуют о том, что коэффициент пересчета дозы для OBoNT и ABoNT должен быть менее 1:3 и что желаемое соотношение должно составлять 1:2,5, что уже отмечалось ранее,5,6,8,23,24, но когда коэффициент пересчета для OBoNT и ABoNT получали на основе ТД20 по показателям CMAP, он составлял 1:2,2, что было даже ниже 1 :2,6. Это объясняет, почему диапазон значений индекса безопасности ABoNT не так широк. Это также свидетельствует о том, что согласно выводам Сампайо и его коллег коэффициент пересчета дозы, который связан только с эффективностью, нельзя было использовать для прогнозирования побочных эффектов.
При сравнении препаратов OBoNT и NBoNT на основе уменьшения амплитуды CMAP, выраженного в процентах от исходного уровня на 4 день после инъекции, NBoNT продемонстрировал значительно более высокую эффективность только при дозе 3,3 Ед/кг; при других дозах разницы не наблюдалось.
ЕД50 по показателям CMAP составляла 0,50 ЕД/кг для обоих препаратов. Индекс безопасности, рассчитанный на основе изменений показателей CMAP, выраженных в процентах, составил 110,3 для NBoNT, что было выше, чем для OBoNT (88,6). Индекс безопасности, рассчитанный с помощью анализа DAS, составил 8,4 для NBoNT, то есть был незначительно выше индекса для OBoNT (7,2). Несмотря на то, что лишь незначительное количество исследований проводилось для сравнения этих токсинов, в одном из таких исследований, посвященном измерению мышечной силы у мышей, сообщалось о подобной эффективности.9 Возможно выводы о том, что коэффициент пересчета доз составляет 1:1 , слишком поспешными, поскольку адекватных и должным образом проведенных клинических сравнений не проводилось, однако оказалось, что эффективность препаратов OBoNT и NBoNT при применении у мышей одинакова. ЕД50 по показателям CMAP составляла 0,50 ЕД/кг для обоих препаратов. Индекс безопасности, рассчитанный на основе изменений показателей CMAP, выраженных в процентах, составил 110,3 для NBoNT, что было выше, чем для OBoNT (88,6). Индекс безопасности, рассчитанный с помощью анализа DAS, составил 8,4 для NBoNT, то есть был незначительно выше индекса для OBoNT (7,2). Несмотря на то, что лишь незначительное количество исследований проводилось для сравнения этих токсинов, в одном из таких исследований, посвященном измерению мышечной силы у мышей, сообщалось о подобной эффективности.9 Возможно выводы о том, что коэффициент пересчета доз составляет 1:1 , слишком поспешными, поскольку адекватных и должным образом проведенных клинических сравнений не проводилось, однако оказалось, что эффективность препаратов OBoNT и NBoNT при применении у мышей одинакова.
Что касается изменения выраженных в процентах показателей CMAP на 4 день после инъекции, IBoNT оказался значительно менее эффективным, чем OBoNT, NBoNT и тройная доза ABoNT в дозах 3,3 ЕД/кг и 10 ЕД/кг. ЕД50 по показателям CMAP составляла 0,53 ЕД/кг, то есть чуть выше 0,50 ЕД/кг, полученных для OBoNT и NBoNT. Таким образом, коэффициент пересчета дозы для OBoNT и IBoNT составил 1:1,07. Индекс безопасности для IBoNT, полученный на основе изменений показателей CMAP в процентном выражении, составил 122,0, что является самым высоким среди токсичных препаратов. Четыре из семи мышей в группе IBoNT с высокой дозой (100 ЕД/кг) остались живы до конца исследования. Таким образом, хотя препарат IBoNT считается менее эффективным, чем другие, при его применении возникает меньше побочных действий. Результаты сравнительных исследований, посвященных изучению влияния препаратов на короткий разгибатель пальцев у здоровых добровольцев, свидетельствуют об эффективности и длительности действия OBoNT и IBoNT, хотя биологические исследования активности препаратов, проведенные путем эксперимента на мышах, показали, что активность препарата IBoNT была меньше, чем OBoNT. 3,4 Результаты, полученные в ходе нашего исследования, свидетельствуют о том, что коэффициент пересчета дозы для препаратов OBoNT и IBoNT может быть несколько больше, чем 1:1, и что активность препарата IBoNT может быть несколько меньше, чем активность OBoNT.
Несмотря на то, что эффективность токсинов в дозах 3,3 и 10,0 ЕД/кг была существенно разной, значительной разницы в изменении показателей CMAP, выраженных в процентах, при низких дозах (0,3 и 1,0 ЕД/кг) не наблюдалось.
Следовательно, показатели эффективности при применении низких доз могут отличаться при клиническом применении, поскольку результаты, полученные при введении этих доз, были разными.
В предыдущих исследованиях, проведенных на мышах, ЭД50 по показателям DAS-анализа для OBoNT составляла 3,5, 6 или 2 ЕД/кг. вывод, что разные определения, установленные для ЭД50 по показателям CMAP и ЭД50 по показателям DAS, стали причиной разрыва между ЭД50 по показателям CMAP и ЭД50 по показателям DAS. ЭД50 по показателям DAS определялась как доза, приводящая к результату 2 в ходе анализа DAS (стопа расслаблена, кончики всех пальцев разведены, или три пальца касаются друг друга) в течение периода пик-эффекта после инъекции токсина, а ЭД50 по показателям CMAP – в качестве дозы, при которой амплитуда CMAP уменьшалась на 50% в течение периода пик-эффекта. Во время DAS-анализа оценивается пальцевый отвод после инъекции ботулотоксина в икроножную мышцу. Известно, что DAS-анализ является воспроизводимым и имеет высокую степень согласованности выводов исследователей,13 но поскольку во время исследования оценивается паралич мышц отведения пальцев, прилегающий к икроножной мышце, а не самой икроножной мышце, в которую вводился препарат , результаты локальной диффузии могут приниматься во внимание, что может быть неправильно истолковано как эффективность. В отличие от этого, регистрация показателей CMAP в мышце, в которую был введен препарат, может быть лучшим методом непосредственной оценки эффективности токсина. Было обнаружено, что пик-эффект наблюдался в течение 2 – 4 дней после инъекции, о чем были получены данные согласно DAS-анализу или путем регистрации амплитуды CMAP, хотя на основе анализа DAS состояние всех мышей восстанавливалось до 56-го дня после инъекции. Тем не менее, исходя из показателей амплитуд CMAP, действие препарата, казалось, длилось до 84 дня после инъекции в группах, получавших высокую дозу. Кроме того, хотя DAS-анализ не продемонстрировал эффект пареза в группе с наименьшими дозами, такие эффекты были наблюдались даже в этой группе путем регистрации амплитуды CMAP. Это позволяет предположить, что данные об изменении амплитуды CMAP более точны, чем результаты DAS-анализа при количественном определении действия ботулотоксина. Поскольку существует мало исследований, в которых сообщается об уменьшении амплитуды CMAP в зависимости от различных доз, ограничения в определении эффективности с свидетельствующей о значительной клинической эффективности установлены определенные применением ЭД50 по данным CMAP. Впрочем, изменения амплитуды CMAP могут быть лучшим показателем химической денервации, чем результаты DAS-анализа, поскольку он оценивает непосредственно мышцу, в которую был введен препарат, выражает результаты в численной форме и более точен.15,16
В данном исследовании была установлена разница в значениях индекса безопасности, полученных при определении CMAP и в ходе анализа DAS: 88,6 по показателям CMAP и 7,2 по результатам DAS-анализа для OBoNT и 75,49 по показателям CMAP и 8,6 по данными DAS-анализа для ABoNT. Индекс безопасности у препарата OBoNT был выше, чем у ABoNT в соответствии с результатами измерения CMAP, но DAS-анализ показал более высокий индекс безопасности при использовании препарата ABoNT. Различные определения ТД20 по значениям CMAP и ЛД50 по показателям DAS-анализа при внутримышечном введении, используемые для расчета индекса безопасности, возможно также привели к таким результатам. При сравнении индексов безопасности препаратов более целесообразным может стать применение индексов безопасности, полученных на основании результатов расслабления мышц, а не летальной дозы.
Это исследование проводилось на мышах для сравнения эффективности и токсичности четырех различных препаратов ботулотоксина, однако применение результатов в клинических условиях требует осторожности. Кроме того, в ходе этого исследования использовались ЭД50 по показателям CMAP, ТД20 по показателям CMAP, ЭД50 по результатам DAS-анализа и ЛД50 по результатам DAS- анализа при внутримышечном введении, полученных на основании одного исследования, что может ограничивать любое обобщение.
Что касается эффективности, для препаратов OBoNT и ABoNT коэффициент пересчета дозы составил 1:2,6, то есть несколько ниже, чем 1:3, согласно предварительным данным. Коэффициент пересчета дозы для препаратов OBoNT и NBoNT составлял 1:1, а для OBoNT и IboNT он равнялся 1:1,07, что было немного выше 1:1, однако эти соотношения базировались только на показателях эффективности без учета побочных эффектов и не должны неправильно трактоваться как показатели биоэквивалентности.
Ссылки
1. Jankovic J, Brin MF. Therapeutic uses of botulinum toxin. N Engl J Med 1991;324:1186–94.
2. Brin MF. Development of future indications for BOTOX. Toxicon 2009;54:668–74.
3. Jost WH, Kohl A, Brinkmann S, Comes G. Efficacy and tolerability of a botulinum toxin type A free of complexing proteins (NT 201) compared with commercially available botulinum toxin type A (BOTOX) in healthy volunteers. J Neural Transm 2005;112:905–13.
4. Hunt T, Clarke K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin Neuropharmacol 2009;32:28–31.
5. Wohlfarth K, Schwandt I, Wegner F, Jrgens T, et al. Biological activity of two botulinum toxin type A complexes (Dysport and Botox) in volunteers: a double-blind, randomized, dose-ranging study. J Neurol 2008;255:1932–9.
6. Wohlfarth K, Sycha T, Ranoux D, Naver H, et al. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment? Curr Med Res Opin 2009;25:1573–84.
7. Wohlfarth K, Kampe K, Bigalke H. Pharmacokinetic properties of different formulations of botulinum neurotoxin type A. Mov Disord 2004;19(Suppl 8):S65–7.
8. Rosales RL, Bigalke H, Dressler D. Pharmacology of botulinum toxin: differences between type A preparations. Eur J Neurol 2006;13(Suppl 1):S2–10.
9. Stone AV, Ma J, Whitlock PW, Koman LA, et al. Effects of Botox and Neuronox on muscle force generation in mice. J Orthop Res 2007;25:1658–64.
10. Aoki KR. Botulinum neurotoxin serotypes A and B preparations have different safety margins in preclinical models of muscle weakening efficacy and systemic safety. Toxicon 2002;40:923–8.
11. Wohlfarth K, Mller C, Sassin I, Comes G, et al. Neurophysiological double-blind trial of a botulinum neurotoxin type A free of complexing proteins. Clin Neuropharmacol 2007;30:86–94.
12. Ranoux D, Gury C, Fondarai J, Mas JL, et al. Respective potencies of Botox and Dysport: a double blind, randomized, crossover study in cervical dystonia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002;72:459–62.
13. Aoki KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A, B, and Finmice. Toxicon2001;39:1815–20.
14. Hallis B, James BA, Shone CC. Development of novel assays for botulinum type A and B neurotoxins based on their endopeptidase activities. J Clin Microbiol 1996;34:1934–8.
15. Torii Y, Goto Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of biological activity of botulinum toxins utilizing compound muscle action potentials (CMAP), and comparison of neuromuscular transmission blockage and muscle flaccidity among toxins. Toxicon 2010;55:407–14.
16. Sakamoto T, Torii Y, Takahashi M, Ishida S, etal. Quantitative determination of the biological activity of botulinum toxin type A by measuring the compound muscle action potential (CMAP) in rats. Toxicon 2009;54:857–61.
17. Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD. Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 1994;128:69–77.
18. Bigalke H, Wohlfarth K, Irmer A, Dengler R. Botulinum A toxin: Dysport improvement of biological availability. Exp Neurol 2001;168:162–70.
19. Yoneda S, Shimazawa M, Kato M, Nonoyama A, et al. Comparison of the therapeutic indexes of different molecular forms of botulinum toxin type A. Eur J Pharmacol 2005;508: 223–9.
20. Cichon JV, McCaffrey TV, Litchy WJ, Knops JL. The effect of botulinum toxin type A injection on compound muscle action potential in an in vivo rat model. Laryngoscope 1995;105:144–8.
21. Osuchowski MF, Teener J, Remick D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve 2009;40:610–6.
22. Aoki KR, Ranoux D, Wissel J. Using translational medicine to understand clinical differences between botulinum toxin formulations. Eur J Neurol 2006;13(Suppl 4): S10–9.
23. Karsai S, Adrian R, Hammes S, Thimm J, et al. A randomized double-blind study of the effect of Botox and Dysport/Reloxin on forehead wrinkles and electromyographic activity. Arch Dermatol 2007;143:1447–9.
24. Hexsel D, Dal’Forno T, Hexsel C, Do Prado DZ, et al. A randomized pilot study comparing the action halos of two commercial preparations of botulinum toxin type A. Dermatol Surg 2008;34:52–9.
25. Sampaio C, Costa J, Ferreira JJ. Clinical comparability of marketed formulations of botulinum toxin. Mov Disord 2004;19 (Suppl 8): S129–36.
26. Aoki KR. Preclinical update on BOTOX ® (botulinum toxin type A)-purified neurotoxin complex relative to other botulinum neurotoxin preparations. Eur J Neurol 1999;6(Suppl 4): S3–10.
Address correspondence and reprint requests to: Joo Hyun Park, MD, PhD, Department of Rehabilitation Medicine, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, Catholic University of Korea, #505 Banpo-Dong, Seocho-Gu, Seoul 137–701, Korea, ore-mail: drpjh@catholic.ac.kr
