Влияние полипептида Wharton Jelly Peptide Р199 на функциональное состояние фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток кожи

УК­РАЇН­СЬКИЙ ЖУР­НАЛ ДЕР­МА­ТО­ЛО­ГІЇ ВЕНЕРОЛОГІЇ КОС­МЕ­ТО­ЛО­ГІЇ — №1 (68) 2018 (скачать)

Авторы:

Е.О.­Денис — ГУ­ «Институт ­геронтологии ­имени­ Д.Ф.­Чеботарева­ НАМН­ Украины», ­Киев

Т.Б.­Папурина — Учебно-научный ­центр­ «Институт ­биологии ­и ­медицины»,­ Киев

А.К.­Коляда — ГУ­ «Институт ­геронтологии ­имени­ Д.Ф.­Чеботарева­ НАМН­ Украины», ­Киев

 

Цель работы — определить влияние соединения sh-Oligopeptide-72 (Wharton Jelly Peptide Р199) на активность и подвижность мезенхимальных стволовых клеток кожи (МСК) и фибробластов in vitro.

Материалы и методы. Первичную культуру фибробластов дермы и МСК получили от здоровых доноров в возрасте 40 лет. Метаболическая и пролиферативная активность клеток исследована при помощи МТТ-теста и теста «заживление раны». Изучены концентрации полипептида от 1 до 1000 нг/мл.

Результаты и обсуждение. Wharton Jelly Peptide Р199 в диапазоне концентраций 1—1000 нг/мл не проявляет ни токсического, ни стимулирующего эффекта на дифференцированные фибробласты. Однако МСК дермы человека оказались чувствительны к действию полипептида P199. Препарат в концентрации 1—2 нг/мл стимулирует метаболическую активность МСК. Выявлено дифференцированное действие препарата на миграционную активность. Показано стимулирующее действие на подвижность МСК дермы, но не зрелых фибробластов дермы.

Выводы. Wharton Jelly Peptide Р199 стимулирует метаболическую, пролиферативную и миграционную активность МСК дермы человека. В отношении фибробластов кожи подобных эффектов не выявлено.

Ключевые слова
Фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки, полипептид P199, Wharton Jelly Peptide Р199, sh-Oligopeptide-72, кожа, дифференцирование, старение.

Благодаря развитию биотехнологических способов получения человеческих пептидов стало возможным их высококачественное производство. В связи с этим в последнее время активно обсуждается потенциальная роль синтезированных рекомбинантных человеческих полипептидов в дерматологии и дерматокосметологии. Данные вещества не ксеногенны, не несут инфекционной опасности и могут производится в больших количествах. Особый интерес представляют пептиды, характерные для тканей пупочного канатика — органа, богатого стволовыми клетками.
Соединение sh-Oligopeptide-72 (Wharton Jelly Peptide Р199) является синтетическим аналогом полипептида, широко представленного в ткани пупочного канатика человека. Это соединение полипептидной природы и рассматривается как стимулятор деления и диф ференциации стволовых клеток эпидермиса и дермы.

Также есть данные о влиянии полипептида на возрастные характеристики кожи [15]. Было показано положительное влияние препарата Meso-Wharton P199, которое заключается в стимулировании процессов обновления клеточных структур дермы и эпидермиса при введении препарата в кожу инъекционным путем [2, 9].

Цель работы — изучить влияние полипептида Р199 (sh-Oligopeptide-72) на показатели активности и подвижности мезенхимальных стволовых клеток кожи (МСК) и фибробластов.

Материалы и методы
Культура фибробластов дермы. Первичную культуру фибробластов дермы получали от здоровых доноров-добровольцев в возрасте 40 лет. Клетки, полученные из эксплантов, культивировали в полной среде (ДМЕМ обогащенная 10 % фетальной бычьей сывороткой) при 100 % влажности температуре 37 °С с 5 % СО 2 . После прохождения трех пассажей и стабилизации куль туры клетки использовали для испытаний [1, 8, 16].

Культура МСК. Первичную культуру мезенхи мальных стволовых клеток получали из под кожного липоаспирата. Липоаспирацию выполняли у доноров-добровольцев среднего возраста. Жир был собран с внутренней поверхности бедер по методике P. Tonnard [4, 11, 18].

Ткань тщательно перемешивали с буфером для отмывания в течение 5 мин, после чего центрифугировали 10 мин при 300 g. Осадок — стромально-васкулярную фракцию (СПФ) — растворяли в 5 мл среды α-МЕМ, обогащенного фетальной бычьей сывороткой (10 %), с добавлением, и вносили в культуральные флаконы с площадью адгезивной поверхности 25 см 2 [5].

МТТ­тест. Использовали концентрацию пептида от 1 до 1000 нг/мл. Клетки инкубировали с тест-агентом в течение 2 сут на 96-луночных планшетах в концентрации 5 тыс. кл/см 2 . После чего проводили замену среды на свежую без целевого пептида и вносили в условиях затемнения раствор МТТ-реагента (5 мг/мл на фосфатном буфере). Инкубация с реагентом длилась 5 ч, после чего среду с реагентом отбирали, а наработанные кристаллы формазана растворяли в 200 мкл 100 % ДМСО, удерживали планшет еще 30 мин при 37 °С и измеряли результаты на спектрометре VARIOSCAN [3, 6, 7, 14].

Тест «заживления раны». Для проведения тестов соответствующие культуры были посеяны в 12-луночные планшеты, где они культивировались при стандартных условиях до достижения полного монослоя. Шпателем снимали протяженную ленту клеток шириной около 1000 мкм в центральной области монослоя. Лунку отмывали чистой средой от разрушенных клеток и заполняли свежей питательной средой с пониженной концентрацией фетальной бычьейсы воротки (2 %) и двумя предварительно выбранными концентрациями исследовательского пептида (250 нг/мл, 10 нг/мл). Контролем выступали лунки с аналогичной средой без пептида [10, 12].

После внесения среды и раствора полипептида сразу проводили фотографирование образованного свободного от клеток поля. Повторные фото делали через 16 и 24 ч. На полученных фотографиях с помощью программного обеспечения CorelPhotopaint измеряли ширину пустого поля царапины для оценки скорости заполнения его мигрирующими клетками [13].

Результаты и обсуждение
Все исследуемые концентрации полипептида P199 (от 1 до 1000 нг/мл) не приводили к изменениям метаболической и пролиферативной активности зрелых фибробластов. Средние значения поглощения раствора формазана, наработанного клетками в среде при разных концентрациях полипептида P199, соответствуют среднему значению данного показателя в контрольной группе (рис. 1). Все значения в исследуемой группе находятся в пределах области стандартного отклонения контрольной группы. На графике представленная зависимость уровня метаболической активности, оцениваемая по коэффициенту поглощения формазана в диапазоне 560—660 нм. Значения приводят в процентах к значению контроля (100 %).

Зрелые фибробласты дермы не чувствительны к полипептиду Р199. Не обнаружено стимулирующего или угнетающего влияния всех изученных концентраций. На основании этого полипептид можно считать нетоксичным для фибробластов дермы.

В результате исследования выявлено стимулирующее действие полипептида P199 в определенных концентрациях на МСК человека. Концентрация от 0,5 мкг/мл до 2 нг/мл не имеет выраженного влияния. Метаболическая активность клеток при воздействии препарата в данных концентрациях была близка к контрольной (рис. 2). При этом препарат в концентрациях 1—2 нг/мл стимулировал метаболическую активность стволовых клеток.

Таким образом, МСК более чувствительны к воздействию препарата, чем фибробласты.

Тест «заживления раны». В экспериментах на фибробластах дермы не выявлено повышения миграционной активности зрелых фибробластов после воздействия на них полипептида P199. Наблюдалась высокая миграционная активность фибробластов — за 60 ч пробелы закрывались полностью. За 20 ч ширина царапины в конт-
рольных образцах уменьшилась на 16 % по отношению к исходной, при концентрации Wharton Jelly Peptide Р199™ 10 нг/мл — на 18 %, а при 250 нг/мл — на 15,2 %. После 46 ч инкубации в контрольной группе было заполнено 56,7 %, при тестовой концентрации 10 нг/мл — 62,1 %, а при 250 нг/мл — 59 %. Динамика движения оказалась близкой для разных групп. Итак, полипептид P199 не влияет на миграционную активность фибробластов.

В отличие от фибробластов МСК, которые инкубировали с полипептидом P199, обнаружили гораздо более высокую миграционную активность, чем при культивировании с контрольным раствором. В контрольной группе ширина пробелов за 18 ч уменьшалась в среднем на 25,8 %, а за 28 ч — на 62 %. В то время как при концентра-
ции пептида 10 нг/мл клетки покрывали 71,6 %
царапины в течение 18 ч, а за 28 ч область повреждения уже была равномерно заполненной клетками (рис. 3).

Более высокая концентрация полипептида P199 имела такой же эффект: за 18 ч — 68,5 %, за 28 ч — почти полное зарастание. Отсутствие разницы между действием высокой и низкой концентраций агента и сам факт мощной стимуляции миграции уже при низкой концентрации 10 нг/мл полипептида Р199 в среде свидетельствуют о специфическом влиянии полипептида P199 на миграционную активность МСК кожи.

Проведенное исследование показало специфичность воздействия полипептида P199 на двигательную и метаболическую активность МСК, а также отсутствие значимого влияния изучаемых концентраций на фибробласты кожи.

Эффекты мезотерапевтических препаратов, содержащих полипептид P199, можно объяснить именно влиянием вещества на миграционную активность МСК, которые рекрутируются из глубоких слоев подкожного основания или дермы и, вероятно, дифференцируясь в фибробласты, восстанавливают истощенный клеточный пул, а затем ремоделируют матриксную составляющую, синтезируя коллагены различных типов, эластин и гликозаминогликаны. Отсутствие стимулирующего эффекта препарата на зрелые фибробласты может быть вызвано его неспособностью активизировать процессы митохондриального дыхания [17].

Выводы
1. Фибробласты дермы взрослого человека не чувствительны к различным концентрациям Wharton Jelly Peptide Р199. Вещество в диапазоне концентраций 1—1000 нг/мл не проявляет ни токсического, ни стимулирующего эффектов на дифференцированные фибробласты.
2. МСК дермы человека чувствительны к полипептиду P199. Препарат в концентрации 1—2 нг/мл стимулирует метаболическую активность МСК.
3. Wharton Jelly Peptide Р199™ стимулирует миграционную активность МСК дермы, но не ее зрелых фибробластов.