Выберите язык:

Проницаемость сосудистой стенки. Экспериментальное обоснование механизмов действия MESOEYE™ С71

В. В. Ашапкин — к. б. н., с.н.с., НИИ физикохимической биологии им.  А. Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Л. И. Кутуева — м. н. с., НИИ физикохимической биологии им. А. Н. Белозерского, Московский государственный университет им.
М. В. Ломоносова
Е. Н. Волкова — д. м. н., профессор, директор Научно-образовательного департамента ООО Premierpharm
Б. Ф. Ванюшин — д. б. н., профессор, членкорр. РАН, заведующий отделом, НИИ физикохимической биологии им. А. Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Целью нашей работы было исследование эффекта воздействия препарата MesoEye™ C71 на уровне экспрессии генов, которые влияют на проницаемость сосудистой стенки.

Введение

Гистологические исследования показывают, что непосредственные причины темных кругов и отеков под глазами весьма разнообразны. Сосудистые проблемы, выражающиеся в ухудшение микроциркуляции со спазмом или дилатацией сосудов, а также повышение проницаемости сосудистой стенки, являются первым этапом формирования эстетических проблем периорбитальной области по времени наступления. Следовательно, состояние микроциркуляторного русла и проницаемость сосудистой стенки в тканях век, как главного звена в обеспечении обменных процессов, являются основополагающими в патогенезе образования периорбитальных грыж, морщин и складок кожи. Состояние проницаемости сосудистой стенки в значительной степени определяются уровнем экспрессии генов, кодирующих хемокины и другие сигнальные молекулы в эндотелиальных клетках кровеносных и лимфатических сосудов. Мы исследовали эффекты препарата MesoEye™ C71 на уровне экспрессии таких генов.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали культивируемые эндотелиальные клетки HMVEC-D (human dermal microvascular endothelial cells), полученные из микрососудов кожи человека и представляющие собой смесь эндотелиальных клеток кровеносных и лимфатических сосудов (компания Lonza, CC-2543). После размораживания клетки культивировали на среде EGM-2 MV Bullet Kit (Lonza CC-3202) при температуре 37 о C в увлажненной атмосфере 5% CO2 в пластиковых чашках Петри в течение двух пассажей. Для оценки влияния MesoEye™ C71 на клетки его добавляли к среде (10 мкл на 1 мл среды) перед началом третьего пассажа и выращивали клетки до формирования монослоя. Контрольные клетки выращивали аналогично, но без добавления препарата. По окончании третьего пассажа среду удаляли, а к клеткам добавляли реагент, стабилизирующий РНК, RN Aprotect Cell Reagent (Qiagen, Германия). Выделение и очистку суммарной РНК из клеток осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем набора. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой цепи к ДНК с помощью набора обратной транскрипции Maxima First Strandc DNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США) по рекомендованной производителем прописи. Уровень экспрессии каждого гена измеряли в трех параллельных экспериментах на независимо полученных образцах клеток (биологические параллели). Полученные данные импортировали в программу Microsoft Excel 2003 и обрабатывали статистически, принимая концентрацию мРНК референсного гена во всех образцах за 1.

Результаты и их обсуждение

Увеличение проницаемости капилляров и венул ускоряет потерю белка и жидкости в межуточное пространство. Продукция межуточной жидкости может при этом увеличиться в 10- 20 раз, что превышает возможности лимфотока и вызывает выраженный отек (рис. 1). Агенты, увеличивающие проницаемость сосудов, и различные цитокины индуцируют внутриклеточные сигналы, приводящие к образованию просветов между эндотелиальными клетками, через которые различные макромолекулы и растворы могут преодолевать эндотелиальный барьер. В большинстве случаев изменения проницаемости быстро обратимы. Проницаемость разных сосудов (вены, артерии, лимфатические сосуды) контролируется по разному.

Показано, что хемокин CXCL12 (он же stromalcell-derivedfactor 1α/SDF1α) уменьшает проницаемость эндотелия кровеносных сосудов, индуцируемую тромбином. Это стабилизирующее действие на эндотелий кровеносных сосудов опосредовано специфическим рецептором CXCL12 − CXCR4.

При добавлении MesoEye™ C71 уровень его экспрессии возрастает в 1,8 раза. Обнаруженный умеренный эффект препарата на активность сигнального пути CXCL12 — CXCR4 приводит к стабилизации эндотелия кровеносных сосудов.

Вход жидкости в лимфатические капилляры происходит под действием гидростатического и осмотического давления, иммунные клетки автономно мигрируют к лимфатическим капиллярам через межуточное пространство, привлекаемые хемокинами. Главную роль в этом процессе играет хемокин CCL21 (CC chemokin eligand 21). Экспрессия гена CCL21 при добавлении MesoEye™ C71 уменьшается в 1,5 раза.

Проницаемость стенок кровеносных и лимфатических сосудов повышается под действием таких цитокинов воспаления, как интерлейкин 1α (IL1A), TNF и интерферон γ (IFNG), заметно уменьшающих уровень кадгерина 5. MesoEye™ C71 уменьшает уровень экспрессии генов TNF и IL1A в 1,5 и 3,8 раза соответственно.

При экспериментальной хирургической лимфедеме в коже хвоста мышей наблюдается повышение уровней экспрессии 429 генов и уменьшение уровней экспрессии 183 генов. Среди первых экспрессия около 120 генов нормализуется добавлением VEGFC. Увеличение активности VEGFC под действием MesoEye™ C71 способствует активации лимфангиогенеза и разрешению лимфедемы.

При экспериментальной хирургической лимфедеме в коже хвоста мышей наблюдается повышение уровней экспрессии 429 генов и уменьшение уровней экспрессии 183 генов. Среди первых экспрессия около 120 генов нормализуется добавлением VEGFC. Увеличение активности VEGFC под действием MesoEye™ C71 способствует активации лимфангиогенеза и разрешению лимфедемы.

При экспериментальной лимфедеме в коже ушной раковины мышей, вызванной UVB-облучением, экспрессия ANGPT1 в виде трансгена подавляла внешние признаки отека. Вероятно, эффекты ANGPT1 связаны именно с индукцией экспрессии CLDN5 и TIE2 (он же TEK receptor tyrosine kinase/ TEK).Экспрессия гена CLDN5 заметно (в 1,6 раза) возрастает при действии MesoEye™ C71. Экспрессия генов ANGPT1 и TIE2 также возрастает — в 4 и 1,7 раза соответственно. Все это свидетельствует о выраженном защитном действии препарата на эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов в условиях, способствующих возникновению повышения проницаемости и локальных отеков.

Интерлейкин 7 (IL7/IL-7) является гомеостатическим цитокином, образующимся в стромальных клетках первичных и вторичных лимфоидных органов, а также в кератиноцитах, гепатоцитах и клетках кишечного эпителия. Дренажная активность лимфатических сосудов кожи у взрослых мышей дикого типа заметно усиливается при инъекциях в течение 7 дней рекомбинантного IL7. Уровень экспрессии гена IL7 в эндотелиальных клетках многократно (приблизительно в 17 раз!) возрастает при действии MesoEye™ C71.

Заключение

MesoEye™ C71 препятствует увеличению проницаемости стенок кровеносных сосудов под действием цитокинов интерлейкина 1α (IL1A) и фактора некроза опухолей (TNF), а также хемокинов воспаления CXCL1, CXCL8 и CCL21, ингибируя экспрессию соответствующих генов, и стимулируя экспрессию гена хемокина CXCL12 (stromalcell–derivedfactor 1α/ SDF1α), стабилизирующего эндотелий кровеносных сосудов. MesoEye™ C71 способствует более эффективному и быстрому разрешению состояний, вызванных нарушением проницаемости сосудов, стимулируя активность сигнальных путей VEGFCVEGFR3, ANGPT1-TIE2 и IL7- IL7RαIL2RG, улучшающих напрямую дренажную функцию лимфатических сосудов и препятствующих увеличению сосудистой проницаемости, диапедезу и возникновению локальных отеков.

Подпишитесь на наши
обновления