Порівняльне дослідження фармакодинамічного ефекту різних препаратів ботулотоксину типу А

ОРИГІНАЛЬНА СТАТТЯ (завантажити статтю)

Автори: SUNG-BEOM KIM, MS; BHUPAL BAN, PHD; KEUN-SUK JUNG, BA, and GI-HYEOK YANG, PHD*

РЕЗЮМЕ Оскільки на світовому ринку з’являються все більше препаратів ботулотоксину (BoNT), виникла клінічна потреба в порівнянні фармакологічних профілів цих препаратів.

МЕТА В ході цього дослідження здійснювалося порівняння трьох різних препаратів: онаботулінумтоксинA (ona-BoNT/A), абоботулінумтоксинA (abo-BoNT/A) та Нейронокс (neu-BoNT/A) на мишачій моделі шляхом аналізу впливу на нервово-м’язову передачу (DAS-аналізу пальцевого відведення).

МЕТОДИ Ефективність, тривалість ефекту та індекс безпеки кожного препарату визначалися після одноразового введення в литковий м’яз правої кінцівки (0-240 ОД/кг маси тіла препарату neu-BoNT/A або ona-BoNT/A; 0-600 Одиниці Спейвуда/кг маси тіла препарату abo-BoNT/A).

РЕЗУЛЬТАТИ Препарати neu-BoNT/A (внутрішньом’язове введення (ВМ), середня ефективна доза (ЕД50) становила 11,2 ± 2,7 ОД/кг) та ona-BoNT/A (ВМ ЕД50 становила 11,9 ± 2,4 ОД/кг) мали подібні ефекти щодо ступеню м’язової слабкості при значно менших дозах, ніж abo-BoNT/A (ВМ ЕД50 становила 41,2 ± 2,4 ОД/кг; p < .001). Індекс безпеки (співвідношення між ВМ ЕД50 та середньою летальною дозою ВМ (ЛД50)) препарату neu-BoNT/A (10,7 ± 2,6 ОД/кг) також був подібний до показника препарату ona-BoNT/A (10,3 ± 1,3 ОД/кг), але значно вищий, ніж у abo-BoNT/A (5,9 ± 0,4 ОД/кг; p < ,02). Результати застосування препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A також виявилися зіставними щодо показників DAS-аналізу та відновлення маси тіла до 29 дня.

ВИСНОВОК Препарати neu-BoNT/A та ona-BoNT/A можуть бути взаємозамінними та використовуватися на основі простого співвідношення дози.

Всі автори є співробітниками компанії “Медитокс, Інк.” (Medytox Inc.), Корея.

Ботулінічні токсини (BoNTs), що виробляються бактеріями Clostridium botulinum, є найсильнішими токсинами, які широко використовують для досягнення паралічу шляхом інгібування вивільнення ацетилхоліну в нервово-м’язовий синапс.1 Існує сім серотипів (типів A-G), і токсин типу А успішно застосовується в медичній практиці, наприклад, для лікування косоокості, геміфаціальних спазмів та спастичності.2,3

На ринку доступні п’ять препаратів BoNT типу A (BoNT/A): онаботулінумтоксинA (ona-BoNT/A; БОТОКС, “Аллерган Інк.” (Allergan Inc.), Ірвайн, Каліфорнія), абоботулінумтоксин A (abo-BoNT/A; Диспорт, “Іпсен Лімітед” (Ipsen Limited.), Рексем, Великобританія), BTXA (Інститут Ланьчжоу, Китай), інкоботулінумтоксинA (inco-BoNT/A; Ксеомін, “Мерц” (Merz), Франкфурт-на-Майні, Німеччина) та Нейронокс (nue-BoNT/A “Медитокс, Інк.” (Medytox Inc.), Чхонвон, Південна Корея). Незважаючи на широке клінічне застосування, порівняльні співвідношення доз або коефіцієнти перерахунку препаратів BoNT залишаються суперечливими, оскільки було доведено, що вони мають відмінності щодо показників ефективності та системної дії.4,5 Незважаючи на те, що коефіцієнт перерахунку для ona-BoNT/A та abo-BoNT/A для клінічного застосування варіюється, навіть за однакових показань для застосування, таких як цервікальна дистонія (1:3-1:5),6,7 співвідношення дози один до одного для inco-BoNT/A та ona-BoNT/A не дає значної різниці в плані ефективності та побічних ефектів для лікування цервікальної дистонії.8 Втім, питання про те, чи існує простий коефіцієнт перерахунку доз для препаратів BoNT, залишається суперечливим.9 Тому існує необхідність у більш глибокому розумінні порівняльних співвідношень доз.

Neu-BoNT/A був схвалений для лікування блефароспазму в Південній Кореї в 2006 році, і нещодавно він став широко використовуватися в Азії та Латинській Америці. В ході дослідження препарат вводився мишам шляхом внутрішньом’язової (ВМ) ін’єкції з метою порівняння показників ефективності, тривалості дії та індексу безпеки препарату neu-BoNT/A з препаратами ona-BoNT/A та abo-BoNT/A. Результати цього фармакодинамічного дослідження на тваринах можуть бути корисними для застосування в клінічних умовах та для фундаментального дослідження цього нещодавно виготовленого препарату BoNT/A.

Матеріали і методи

Тварини

Самки мишей ICR CD1 (18-23 г; компанія “Орієнт Біо, Інк.” (Orient Bio, Inc.), отримані від “Чарльз Рівер” (Charles River), Соннам, провінція Кьонгі, Корея) розподілені по групам по 10 осіб утримувалися при 12-годинному циклі світла-темрявиз вільним доступом до їжі та води. Комітет з питань використання піддослідних тварин компанії “Медитокс, Інк.” затвердив це дослідження у відповідності до законодавства про захист тварин.

Приготування та введення токсину

Вміст кожного флакону розводили і вводили відповідно до процедури, описаної вище.4 Три препарати BoNT/A (neu-BoNT/A, ona-BoNT/A та abo-BoNT/A) відновлювалися в однаковому об’ємі сольового розчину для кожного експерименту. Для зручності 500 s.ОД (одиниць Спейвуда) abo-BoNT/A прийняли за 100 ОД, тому отримані дані щодо abo-BoNT/A множилися на п’ять. Після відновлення препарати послідовно розводили із застосуванням сольового розчину до дев’яти доз (0,0; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 30,0; 60,0; 120,0; 240,0 ОД/кг маси тіла). Одна ОД препарату neu-BoNT / A розраховувалася шляхом вимірювання середньої летальної дози (ЛД50), введеної внутрішньочеревно (ВЧ), у самок мишей ICR CD1.

Всі миші отримували одноразово внутрішньом’язову ін’єкцію 5 мкл нейротоксину або розчину (фізіологічного) в головку литкового м’язу правої кінцівки за допомогою голки 28-G шприца Гамільтон 25 мкл. Для кожного експерименту 10 мишам вводили одну дозу, введення виконували послідовно, від низької до високої концентрації. Експерименти повторювали три-шість разів.

Аналіз впливу на нервово-м’язову

В ході дослідження було застосовано модифікований аналіз пальцевого відведення (DAS).4,10 Учасники сліпого дослідження, які робили ін’єкції та спостерігали за ходом процесу, окремо оцінювали стартл-рефлекс, при якому тварина розгинає задні кінцівки і розводить пальці. Ступінь пальцевого відведення оцінювали за 5-бальною шкалою (від 0 = нормальне до 4 = мінімальне відведення пальців та розгинання кінцівки). Середня ефективна доза (ЕД50) та середня летальна доза (ЕД50) при внутрішньом’язовому введенні були розраховані на основі пік-ефекту за результатами DAS-аналізу для кожної дози та кількості загиблих мишей.

ЕД50, ЛД50 при внутрішньом’язовому введенні та індекс безпеки

Дози, після введення яких було отримано значення розслаблення м’язів, що дорівнювало половині від максимальної величини (ВМ ЕД50), розраховувалися за допомогою рівнянь логарифмічної регресії для показників пік-ефекту за шкалою DAS-аналізу для кожного препарату. Значення розслаблення, що дорівнювало половині максимального, відповідало пункту 2 за шкалою DAS-аналізу. Пік-ефект за шкалою DAS-аналізу зазвичай спостерігався на 2 день.

Дозу, після введення якої половина мишей у кожній групі загинула, визначали як ВМ ЛД50. За мишами спостерігали протягом 4 днів після ін’єкції, оскільки більшість мишей з важкими симптомами загинули протягом 4 днів.

Індекс безпеки розраховували шляхом ділення ВМ ЛД50 на ВМ ЕД50. 4 Це співвідношення відображає діапазон значень індексу безпеки, в якому можна ефективно вводити препарат, а також взаємозв’язок між середньою летальною дозою та середньою розслаблювальною дозою.5

Статистичний аналіз

Порівняння значень та індексів безпеки ВМ ЕД50 та ВМ ЛД50 здійснювалося за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та t-критерія за отриманими результатами. Тривалість дії порівнювали за допомогою двофакторного аналізу ANOVA, однофакторного аналізу ANOVA та t-критерія для порівняння значень залежно від часу. p < .05 було прийнято за рівень статистичної значущості.

Результати

Реакція на дозу за шкалою DAS-аналізу

Всі препарати спричиняли залежне від дози збільшення значень за шкалою DAS-аналізу, що можна побачити на графіку, на якому позначено дози та відповідні максимальні реакції за шкалою DAS-аналізу (рис. 1). Об’єми введених токсинів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A, ефект яких відповідав пункту 4 за шкалою DAS-аналізу на 2 день, були однаковими (120 ОД/кг маси тіла), тоді як при застосуванні abo-BoNT/A потрібне введення більшого об’єму для досягнення такого ж ефекту (300 s.ОД/кг маси тіла). Рівняння для визначення відповідної кривої логарифмічної регресії наступні: y = 0,8454Ln(x)—0,0679 для шести флаконів препарату neu-BoNT/A, y = 0,8371Ln(x)—0,1122 для шести флаконів ona-BoNT/A, та y = 1,1109Ln(x)-1,9939 для трьох флаконів abo-BoNT/A. Криві DAS-аналізу для neu-BoNT/A та ona-BoNT/A були майже ідентичними (рис. 1).

Тривалість дії та маса тіла

Хоча при введенні дози 60 ОД/кг маси тіла препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A, а також 150 s.ОД/кг маси тіла препарату abo-BoNT/A отримували зіставні результати за шкалою DAS-аналізу, abo-BoNT/A продемонстрував вищу ефективність (день 3 і 10, p < .05). Схеми відновлення до 29-го дня після ін’єкції були зіставними для всіх препаратів. Показники за DAS-аналізом зростали протягом 2 днів після ін’єкції, швидко відновлювались до 7-го дня, а потім повільно продовжували відновлюватися (рис. 2А). При цих дозах не було помічено суттєвої різниці у тривалості дії препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A до 29 дня (рис. 2А). Більше того, маса тіла мишей, яким вводили однакову кількість препарату (60 ОД/кг маси тіла) neu-BoNT/A або ona-BoNT/A, відновлювалася аналогічним чином (рис. 2B).

Рис. 1. Крива залежності максимального показника за шкалою пальцевого відведення (DAS) від дози. Доза зазначається в ОД/кг маси тіла. Усі криві представляють собою максимально точні логарифмічні криві регресії та середні значення, отримані в ході трьох-шести експериментів. Середні ефективні дози визначаються за цим графіком як дози, що призводять до ефекту, який відповідає пункту 2 за шкалою DAS-аналізу

ВМ ЕД50, ЛД50 та індекс безпеки

ВМ ЕД50 і ЛД50 для препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A були зіставними, але нижчими, ніж для abo-BoNT/A (таблиця 1), що свідчить про те, що аналогічного ступеня розслаблення можна досягти при введенні тієї ж дози препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A, та більшої дози препарату abo-BoNT/A.

Рис. 2. Тривалість дії (A) та відновлення маси тіла (B). Всі криві представляють собою середні значення, отримані протягом трьох-шести експериментів. Зірочками позначені значні відмінності між препаратами Нейронокс та абоботулінумтоксинA (p < .01).

Відповідно до даних у таблиці 1 індекс безпеки препарату abo-BoNT/A був значно нижчим, ніж препаратів neu-BoNT/A та або-BoNT/A, що вказує на те, що співвідношення ВМ ЛД50 – ВМ ЕД50 було нижчим, ніж для двох інших препаратів.иготовленого препарату BoNT/A.

Обговорення

Відмінності в чистоті та складі наявних на ринку препаратів BoNT/A можуть впливати на їх фармакодинаміку. В ході цього дослідження було встановлено залежність реакції від дози, тривалість дії та індекс безпеки neu-BoNT/A для мишей, а також було здійснено порівняння результатів застосування препарату з результатами, отриманими для ona-BoNT/A та abo-BoNT/A.

Взаємозв’язок доза-реакція при застосуванні препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A не змінювався з точки зору розслаблення м’язів (рис. 1), хоча реакція при застосуванні препарату abo-BoNT/A була слабшою, ніж у випадку інших двох препаратів, а коефіцієнт перерахунку дози для або-BoNT/A та інших двох
препаратів варіювався залежно від дози. Таким чином, співвідношення один до одного для препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A може бути виправданим, але нам не вдалося визначити фіксоване незалежне співвідношення дози для препаратів neu-BoNT/A та abo-BoNT/A.

Вищі індекси безпеки означають більший розрив між ЕД50 і ЛД50. 4 Було встановлено, що abo-BoNT/A мав найнижчий індекс безпеки – приблизно вдвічі менший від інших двох препаратів (табл. 1), незважаючи на те, що neu-BoNT/A та ona-BoNT/A мали аналогічні індекси безпеки. Це свідчить про те, що співвідношення між ВМ ЛД50 та ВМ ЕД50 для препарату neu-BoNT/A не відрізняється від такого співвідношення для ona-BoNT/A. Значення ВМ ЕД50 та ВМ ЛД50 відрізнялися від значень, отриманих раніше під час експериментів на швейцарських мишах Вебстер.4 Використання різних систем догляду за тваринами та різних видів тварин може бути причиною отримання різних значень ВМ ЕД50 та ВМ ЛД50, хоча нами було встановлено, що значення індексів безпеки для препаратів ona-BoNT/A та abo-BoNT/A були подібними до попередніх значень (1.8).4

ВМ ЛД50 відображає кількість токсину, що надходить з м’яза (цільової ділянки), і використовується для розрахунку індексу безпеки. Теоретично, токсин, що розповсюджується з місця ін’єкції, може впливати на рівень летальності, тому ВМ ЛД50 не слід плутати з ВП ЛД50 які визначаються як одиниці токсину.4 Індекс безпеки, встановлений для neu-BoNT/A, свідчить про те, що цей препарат може розповсюджуватися з цільової ділянки і проникати в системний кровообіг подібно до ona-BoNT/A. Інші фармакодинамічні властивості препарату neu-BoNT/A також подібні до ona-BoNT/A, зокрема тривалість ефекту та відновлення маси тіла (рис. 2).

Відмінності в значеннях індексу безпеки для препаратів neu-BoNT/A та або-BoNT/A можуть бути обумовлені різницею в молекулярній масі (900 кДа і 500-900 кДа відповідно) та складі (500 мкг альбуміну на флакон та 125 мкг альбуміну плюс 2,5 мг лактози на флакон).4,5 Ці відмінності можуть впливати на стабільність та проникність у місці ін’єкції.

Незважаючи на існування обмежень у застосуванні цих даних безпосередньо до людей,10 і необхідності подальших досліджень, наші результати свідчать про те, що перерахунок однієї дози у співвідношенні 1:1 є можливим, оскільки криві доза-реакція для препаратів neu-BoNT/A та ona-BoNT/A є ідентичними. Наші висновки узгоджуються з висновками двох попередніх клінічних досліджень, в ході яких були отримані показники ефективності та індекс безпеки препарату neu-BoNT/A, зіставні з показниками для ona-BoNT/A при лікуванні есенціального блефароспазму та спастичності при церебральному паралічі.11,12

Посилання

1. Simpson LL. The origin, structure, and pharmacological activity of botulinum toxin. Pharmacol Rev 1981;33(3):155–88.

2. Grazko MA, Polo KB, Jabbari B. Botulinum toxin A for spasticity, muscle spasms, and rigidity. Neurology 1995;45 (4):712–7.

3. Jankovic J, Schwartz K, Donovan DT. Botulinum toxin treatment of cranial-cervical dystonia, spasmodic dysphonia, other focal dystonias and hemifacial spasm. J Neurol Neurosurg Psychiatr 1990;53(8):633–9.

4. Aoki KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon 2001;39 (12):1815–20.

5. Aoki KR, Ranoux D, Wissel J. Using translational medicine to understand clinical differences between botulinum toxin formulations. Eur J Neurol 2006;13 (Suppl 4):10–9.

6. Bhaumik S, Behari M. Botulinum toxin A-injection for cervical dystonia. J Assoc Physicians India 1999;47(3):267–70.

7. Ranoux D, Gury C, Fondarai J, Mas JL, et al. Respective potencies of Botox and Dysport: a double blind, randomized, crossover study in cervical dystonia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002;72(4): 459–62.

8. Benecke R, Jost WH, Kanovsky P, Ruzicka E, et al. A new botulinum toxin type A free of complexing proteins for treatment of cervical dystonia. Neurology 2005;64(11):1949–51.

9. Rosales RL, Bigalke H, Dressler D. Pharmacology of botulinum toxin: differences between type A preparations. Eur J Neurol 2006;13(Suppl 1):2–10.

10. Aoki KR. Botulinum neurotoxin serotypes A and B preparations have different safety margins in preclinical models of muscle weakening efficacy and systemic safety. Toxicon 2002;40(7): 923–8.

11. Kim K, Shin HI, Kwon BS, Kim SJ, et al. Neuronox versus BOTOX for spastic equinus gait in children with cerebral palsy: a randomized, double-blinded, controlled multicentre clinical trial. Dev Med Child Neurol 2011;53(3):239–44.

12. Yoon JS, Kim JC, Lee SY. Double-blind, randomized, comparative study of Meditoxin versus Botox in the treatment of essential blepharospasm. Korean J Ophthalmol 2009;23(3): 137–41.