Порівняльне дослідження біологічної активності чотирьох препаратів ботулотоксину типу а в експерименті на мишах

ОРИГІНАЛЬНА СТАТТЯ (завантажити статтю)

Автори: MYUNG EUN CHUNG, MD, PHD;* DAE HEON SONG, MD, PHD;* AND JOOH YUN PARK, MD, PHD †

РЕЗЮМЕ Досліджувані препарати ботулотоксину не є взаємозамінними, і коефіцієнт перерахунку дози для цих препаратів залишається суперечливим.

МЕТА Порівняння ефективності та безпеки чотирьох препаратів ботулотоксину типу А.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Сумарні потенціали дії литкових м’язів (CMAP) у мишах було зареєстровано до та після ін’єкції чотирьох препаратів ботулотоксину (онаботулінумтоксинA, абобоботулінумтоксинA, новий ботулінічний токсин та інкоботулінумтоксинA).

РЕЗУЛЬТАТИ Для всіх препаратів після їх введення амплітуди CMAP зменшувались протягом 4 днів, а потім поступово відновлювались. На 84 день після ін’єкції амплітуди поверталися до вихідних значень у всіх групах, крім груп, що отримували високі дози. Амплітуда CMAP у контралатеральній кінцівці також зменшувалась протягом 4-7 днів після ін’єкції, а потім поступово поверталася до вихідного рівня до 28 дня.

ВИСНОВОК Було визначено коефіцієнт конверсії доз для препаратів онаботулінумтоксинА та абоботутулінумтоксинА, який становив 1:2,6; коефіцієнт 1:3, зазначений у попередніх висновках, визнано завищеним. Коефіцієнт перерахунку доз для препарату онаботулінумтоксинА та нового ботулінічного токсину 1:1 було визнано доцільним. Для преапаратів онаботулінумтоксинА та інкоботулінумтоксинА коефіцієнт перерахунку становив 1:1,07. Ефективність препарату інкоботулінумтоксинА була трохи нижчою за дію препарату онаботулінумтоксинА. Ці коефіцієнти конверсії застосовуються виключно для розрахунку ефективної, а не безпечної дози. Це дослідження проводили на мишах, тому його результати не можуть бути повною мірою застосовні в медичних цілях.

Спонсором дослідження виступила компанія “Медитокс Інк.” (Medytox Inc.), Корея

Ботулотоксин типу А – це токсин, що виробляється анаеробними бактеріями Clostridium botulinum, і представляє собою білковий комплекс молекулярною масою 900 кДа у своєму природному стані. Комплекс складається з нейротоксичних компонентів, нетоксичних білків та гемаглютиніну вагою 150 кДа.1 Його клінічне застосування розпочалось у 1970-х роках, і з того часу сфера його застосування розширилася, включивши випадки дистонії (блефароспазм та цервікальної дистонії), м’язової спастичності, аксилярного гіпергідрозу, мігрені та для посилення дії анестетиків.2,3

До препаратів ботулотоксину типу А, доступних в продажу, входять онаботулінумтоксинA (OboNT) (БОТОКС, “Аллерган, Інк.” (Allergan

Inc.), Ірвайн, Каліфорнія), абоботулінумтоксин A (ABoNT) (Диспорт “Іпсен Лімітед” (Ipsen Limited.), Рексем, Великобританія),нкоботулінумтоксинA (IBoNT), (Ксеомін, “Мерц” (Merz), Франкфурт-на-Майні, Німеччина) та нейронокс (NBoNT) (“Медитокс, Інк.” (Medytox Inc.), Чхонвон, Південна Корея). Молекулярна маса препарату OBoNT становить 900 кДа, оскільки він представляє собою поєднання нейротоксичних компонентів та комплексоутворюючих білків масою 150 кДа. Молекулярна маса ABoNT становить 500-900 кДа, а NBoNT – 900 кДа. На відміну від інших препаратів ботулотоксину типу А, IBoNT має молекулярну масу 150 кДа, оскільки складається лише з нейротоксичних компонентів.4 Ці препарати мають різну ефективність та рівень безпечності завдяки своєму унікальному біологічному походженню, а щодо коефіцієнта перерахунку доз препаратів ведуться дискусії.5,6

Повідомляється, що коефіцієнт перерахунку доз препаратів OBoNT та ABoNT варіюється від 1:1 до 1:6, але в нових публікаціях коефіцієнт 1:4 і більше не схвалюється.5-8 Незважаючи на те, що лише в кількох дослідженнях порівнювалися препарати NBoNT та OBoNT, Стоун та його колеги повідомили, що NBoNT та OBoNT мали однакові показники ефективності.9 У деяких дослідженнях, що в них порівнювалися препарати IBoNT та OBoNT, повідомлялося про еквівалентну ефективність та стабільність, тоді як інші повідомили, що IBoNT є менш дієвим, ніж OBoNT.3,4,10,11 Постійний коефіцієнт перерахунку для препаратів важко застосовувати, тому під час лікування мали місце непередбачені побічні ефекти, що виникли в результаті застосування різних препаратів ботулінового токсину типу А. Наприклад, коли під час дослідження ефективності для лікування цервікальної дистонії застосовували препарати OBoNT та ABoNT з коефіцієнтом 1:3, у групі OBoNT частота дисфагії була вищою, ніж у групі ABoNT.12

Для оцінки біологічної активності ботулотоксину типу А використовуються різні методи. Визначення середньої летальної дози (ЛД50) у мишей при введенні речовини інтраперитонеально (ІП) – це кількісний метод, який застосовують після введення токсину в черевну порожнину мишей. Додатковими кількісними методами є вимірювання активності ендопептидази in vitro за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) та кількісні тести in vivo, що складаються з аналізу впливу на нервово-м’язову передачу (DAS – digit abduction scoring).13,14 Існують також кількісні методи випробування ex vivo, наприклад, використання діафрагмального нерва – купола діафрагми мишей. Із методів, наведених вище, метод ЛД50 шляхом ІП є менш ефективним, оскільки він не оцінює вплив токсину на пригнічення нервово-м’язової передачі, а дозволяє оцінити летальність через параліч дихальних м’язів.15,16 Крім того, для точної оцінки потрібно більше даних.17 Метод ІФА, за допомогою якого вимірюється активність ендопептидази, проводиться без використання тварин (і, отже, є економічно вигіднішим), але він менш точним, ніж біологічний дослід на мишах.14 Метод із використанням діафрагмального нерву мишей є точним, але вимагає певних технічних навичок, а також не передбачає можливості відтворюваності.18,19 В ході DAS- аналізу використовується шкала оцінки, але іноді важко розрізнити між собою два отримані результати, а самі результати представляють собою дискретні дані.15,16

Біологічну активність ботулотоксину можна оцінити шляхом визначення сумарного потенціалу м’язової дії (CMAP), за допомогою якого оцінюється пригніченість нервово-м’язової передачі.20 CMAP, який представляє собою посилений і зареєстрований електричний імпульс, що виникає під час скорочення м’язів, може чисельно виражати ступінь пригнічення нервово-м’язової передачі. Проведено низку клінічних випробувань з метою аналізу ефективності ботулотоксину шляхом отримання CMAP в коротких розгиначах пальців людини. У ряді експериментів на піддослідних тваринах оцінювали ефективність дії ботулотоксину шляхом визначення CMAP.3,5,7,11,15,16,20,21

Таким чином, нами було проведено оцінку та порівняння ефективності, а також розрахунок коефіцієнтів перерахунку дози чотирьох доступних у продажу препаратів ботулотоксину типу А шляхом визначення CMAP

Матеріали і методи

Тварини

Самки мишей ICR/CD-1 (віком 8 тижнів, вагою приблизно 30 г кожна) були придбані в компанії “Орієнт Біо, Інк.” (Orient Bio, Inc.) (Сандевон, Соннам, Південна Корея), розподілені по групам по сім осіб, утримувалися при 12-годинному циклі світла-темряви з вільним доступом до їжі та води. Комітет з питань використання піддослідних тварин Медичного коледжу Католицького університету Кореї затвердив протокол.

Приготування та введення токсину

Організатор сліпого експерименту, який не брав участі у визначенні CMAP або DAS-аналізі, підготував чотири препарати ботулотоксину типу А, доступні на ринку. Кожен токсин був відновлений і розведений у 5 мкл фізіологічного розчину. Триста ОД ABoNT було прийнято за еквівалент 100 ОД інших токсичних препаратів для спрощення порівняння. З метою знеболення мишам було зроблено ІП ін’єкції кетаміну гідрохлориду в обсязі 0,25 мг. Задню кінцівку голили і вводили 5 мкл розведеного токсину в литковий м’яз після ін’єкції наркозу за допомогою шприца Гамільтон 26-G (“Гамільтон Компані” (Hamilton Company), Ріно, Невада) в наступних дозах: 0,0; 0,3; 1,0; 3,3; 10,0; 33,3; 100,0 ОД/кг для груп OBoNT, NBoNT та IBoNT, а також 0,0; 1,0; 3,0; 10,0; 30,0; 100,0; 300,0 ОД/кг для групи ABoNT. Кожна група складалася з семи мишей, яким вводили певну дозу препарату.

Зареєстровані значення CMAP

Визначення CMAP здійснювалося з використанням електроміографу “Ніколет Вайкінг Квест” (Nicolet Viking Quest) (“Вайасис Хелскеа” (Viasys Healthcare), Медісон, Вісконсин). Мишам вводили знеболювальне та фіксували їх в положенні лежачи. Перед визначенням CMAP місце введення електрода поголили. Температура на поверхні шкіри підтримувалася на рівні 32-36 ° C за допомогою нагрівальної лампи та нагрівальної плити. Виміри температури на поверхні шкіри здійснювалися за допомогою безконтактного інфрачервоного термометра (PT-3S, “ОПТЕКС” (OPTEX), Токіо, Японія) у місці введення вимірювального електрода. Для стимуляції голчасті електроди з нержавіючої сталі розміром 1 см розміщували підшкірно на всю довжину голки. Анод вводився поперек тіла миші в середній частині, а кінчик голчастого електрода було введено на відстані 1 мм від основи хвоста в напрямку до хвоста. Катод було введено на 3 мм збоку від анода. 1-сантиметрову підшкірну голку вводили в стегно тієї ж кінцівки в якості електроду заземлення, а в якості вимірювального електрода використовували 6-міліметровий золотий вушний чашечковий електрод з затискачем. Вимірювальний електрод розміщувався на широкій частині литкового м’яза, а контрольний – на сухожиллі. Інтенсивність поступово збільшували до моменту отримання постійного максимального значення амплітуди CMAP без виникнення артефактів. Сила струму при формуванні більшості електричних подразників становила 10-40 мА тривалістю 0,1 мс. Налаштування фільтра – 2-10000 Гц. CMAP мишей вимірювали до (0) та через 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 70 та 84 дні після ін’єкцій ботулотоксину А.

DAS-аналіз

Порівняння чотирьох препаратів ботулотоксину типу А проводилося за допомогою аналізу DAS з метою визначення ефективності.

Після ін’єкцій ботулінічного токсину спостерігач, якому був невідомий тип використовуваного препарату, оцінював різні ступені впливу на нервово-м’язову передачу за 5-бальною шкалою розведення пальців (0 = стопа розслаблена, пальці розведені, як і на кінцівці, в яку не було введено препарат; 1 = стопа розслаблена, пальці зведені більше, ніж на кінцівці, в яку не було введено препарат, або два пальці зведені, а решта повністю розведені; 2 = стопа розслаблена, кінчики всіх пальців трохи розведені, або три пальці торкаються один одного; 3 = п’ять пальців зведені, але стопа розслаблена, або чотири пальці зведені, а стопа зігнута; 4 = стопа зігнута, всі п’ять пальців зведені).12,21 Такий аналіз проводився на 0, 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 та 56 дні після ін’єкції.

Статистичний аналіз

Отримані середні значення та стандартні відхилення амплітуд CMAP, а також ступінь відхилення (у відсотках) від вихідного рівня. Було виконано однобічний дисперсійний аналіз для кожної дози з метою порівняння ефективності чотирьох різних препаратів, а також застосовано критерій Дункана в якості ретроспективного аналізу. Для аналізу використовували показники CMAP, отримані у день, коли кожен препарат мав би дати максимальний ефект для розрахунку середньої ефективної дози за показниками CMAP (ЕД50) і токсичної дози за показниками CMAP (ТД20). ЕД50 за показниками CMAP визначали як дозу, що спричиняє 50% зменшення амплітуди CMAP у порівнянні з вихідними значеннями в місці введення препарату. ТД20 за показниками CMAP визначали як зменшення значення амплітуди CMAP на 20% у порівнянні з вихідними значеннями, отриманими на місці, протилежному місцю ін’єкції. ЕД50 та ТД20 за показниками CMAP визначалися за допомогою пробіт-аналізу. Метод SAS 9.1 (“Інститут САС, Інк.” (SAS Institute, Inc.), Кері, Північна Кароліна) використовувався для статистичного аналізу та p < .05 було прийнято за рівень статистичної значущості.

Результати

Зміни амплітуди CMAP в залежності від часу в литковому м’язі після введення препарату

Амплітуду CMAP було встановлено з метою проведення електрофізіологічної кількісної оцінки ефектів хемоденервація після інтрамускульного введення ботулотоксину. Для всіх препаратів амплітуда CMAP зменшувалася залежно від дози. Максимальне зниження спостерігалося приблизно на 4 день, після чого амплітуда CMAP починала поступово відновлюватися. До 84-го дня після ін’єкції значення амплітуди повернулося до вихідного рівня для всіх груп, крім груп 33,3 ОД/кг для OBoNT, NboNT або IBoNT та групи 100 ОД/кг для ABoNT (рис. 1). У групах із найбільш високими дозами (OBoNT, NBoNT, IBoNT: 100 ОД/кг, ABoNT: 300 Од/кг) всі тварини загинули через 2-4 дні після ін’єкції, за винятком групи IBoNT 100 ОД/кг, в якій чотири з семи мишей залишилися живими до кінця дослідження.

Зміни амплітуди CMAP з часом у литкових м’язах протилежної кінцівки, в яку не було введено препарат

Амплітуду CMAP в литковому м’язі лівої кінцівки було визначено для виявлення ефектів дифузії на протилежну сторону. Зменшення амплітуди CMAP в залежності від дози відзначалося для всіх препаратів ботулотоксину типу А. Не спостерігалось зменшення амплітуди CMAP при дозі 3,3 ОД/кг чи менше для OBoNT, NBoNT або IBoNT, або при 10 ОД/кг чи менше для ABoNT. Для доз 10 ОД/кг чи більше для OBoNT, NBoNT або IBoNT та 30 ОД/кг або вище для ABoNT амплітуда CMAP зменшувалася протягом 4-7 днів після ін’єкції, а потім поступово відновлювалась. На 28 день після ін’єкції амплітуда поверталася до вихідного рівня для всіх препаратів токсинів (рис. 2).

Порівняння ефективності за значеннями амплітуд CMAP

Для порівняння ефективності чотирьох препаратів було визначено зменшення амплітуди CMAP у відсотках від вихідного значення амплітуди CMAP на 4 день після ін’єкції (табл. 1). При дозі 3,3 ОД/кг препаратів OBoNT, NboNT та IBoNT, а також 10 ОД/кг препарату ABoNT, CMAP становив 11,3 ± 4,6% для OBoNT, 4,0 ± 1,8% для ABoNT, 4,8 ± 1,5% для NBoNT та 17,3 ± 6,6 % для IBoNT. Спостерігалося набагато більше зменшення амплітуди CMAP для NBoNT та ABoNT, ніж для OBoNT, і значно більше зменшення амплітуди CMAP для OBoNT, ніж IBoNT (p < .001). При дозі 10 ОД/кг препаратів OBoNT, NBoNT та IBoNT, а також 30 ОД/кг препарату ABoNT CMAP становив 1,4 ± 0,8% для OBoNT, 0,7 ± 0,1% для ABoNT, 1,4 ± 0,6% для NBoNT та 3,6 ± 3,1% для IBoNT. Зменшення амплітуди CMAP було однаковим для препаратів OBoNT, AboNT та NBoNT, але всі три препарати токсинів викликали значно більше зменшення амплітуди CMAP, ніж IBoNT (p =.02). Крім того, ЕД50 за показниками CMAP, яку визначали як дозу препарату токсину, що зменшує амплітуду CMAP на 50% після ін’єкції, було розраховано для пікового ефекту при кожній дозі (табл. 2). ЕД50 за показниками CMAP становила 0,50 ОД/кг для OBoNT та NBoNT, але була дещо вищою для IBoNT (0,53 ОД/кг) та ABoNT (1,30 ОД/кг). Ефективність препаратів, розраховану на основі ED50 за показниками CMAP, була аналогічною для OBoNT та NBoNT. Для IBoNT це значення було трохи нижчим, ніж для інших двох препаратів, а для ABoNT – трохи вищим, ніж для OBoNT, при коефіцієнті 1:3. Коефіцієнт перерахунку дози для OBoNT та NBoNT становив 1: 1, для OBoNT та ABoNT він склав 1:2,6, а для OBoNT та IBoNT становив 1:1,07.

ТД20 за значенням CMAP та індекс безпеки для препаратів ботулотоксину типу А

Для порівняння ефекту дифузії токсинів на протилежний бік для кожного препарату ботулотоксину типу А було розраховано ТД20, за показниками CMAP, що є дозою, яка викликає 20% зменшення амплітуди CMAP в литкових м’язах лівої кінцівки (таблиця 2). ТД20 за показниками CMAP становила 99,0 ОД/кг для ABoNT, 65,2 ОД/кг для IBoNT, 54,9 ОД/кг для NBoNT та 45,0 ОД/кг для OBoNT. Індекс безпеки, що його було отримано діленням ТД 20 за показниками CMAP на значення ЕД50 за показниками CMAP, становив 122,0 для IBoNT, 110,33 для NBoNT, 88,6 для OBoNT та 75,5 для ABoNT (таблиця 2).

Порівняння показників ефективності за
допомогою аналізу DAS

Усі препарати викликали збільшення інтенсивності та періоду м’язової слабкості в залежності від дози в ході DAS-аналізу (рис. 3). Було розраховано ED50 за показниками DAS, яку було визначено як дозу, що приводить до результату 2 за шкалою DAS після ін’єкції від моменту пік-ефекту при кожній дозі (таблиця 3). Для визначення системної дії ботулотоксинів було розраховано дозу ЛД50 за показниками DAS при внутрішньом’язовому введенні, що визначається як доза, яка призводить до загибелі 50% мишей після введення токсину (таблиця 3). Препарат NBoNT мав найнижчу ЕД50 (7,1 ОД/кг) за шкалою DAS, яка суттєво не відрізнявся від показника OBoNT (8,2 ОД/кг)

Рис. 2. Зміни в амплітуді сумарного м’язового потенціалу (CMAP) залежно від часу при застосуванні різних препаратів ботулотоксину типу А, що реєструються в протилежній кінцівці, в яку не було введено препарат. Амплітуду CMAP вимірювали від вихідного рівня до піку в литкових м’язах лівих кінцівок всіх мишей до та через 1, 2, 4,7, 14, 21, 28,35, 42, 49, 56,70 та 84 дня після ін’єкції. Кожна точка представляє собою середнє ± стандартне відхилення, n =7. : 0,3 ОД/кг (1,0 ОД/кг для препарату абоботулінумтоксинA (ABoNT)), : 1,0 ОД/кг (3,0 ОД/кг для ABoNT), : 3,3 ОД/кг (10,0 ОД/кг для ABoNT), : 10,0 Од/кг (30,0 ОД/кг для ABoNT), : 33,3 ОД/кг (100,0 ОД/кг для ABoNT), : 100,0 ОД/кг (300,0 ОД/кг для ABoNT).

Рис. 1. Зміни в амплітуді сумарного м’язового потенціалу (CMAP) залежно від часу при застосуванні різних препаратів
ботулотоксину типу А, що реєструються в протилежній кінцівці, в яку не було введено препарат. Амплітуду CMAP вимірювали від
вихідного рівня до піку в литкових м’язах лівих кінцівок всіх мишей до та через 1, 2, 4,7, 14, 21, 28,35, 42, 49, 56,70 та 84 дня після
ін’єкції. Кожна точка представляє собою середнє ± стандартне відхилення, n =7. : 0,3 ОД/кг (1,0 ОД/кг для препарату
абоботулінумтоксинA (ABoNT)), : 1,0 ОД/кг (3,0 ОД/кг для ABoNT), : 3,3 ОД/кг (10,0 ОД/кг для ABoNT), : 10,0 Од/кг (30,0 ОД/кг
для ABoNT), : 33,3 ОД/кг (100,0 ОД/кг для ABoNT), : 100,0 ОД/кг (300,0 ОД/кг для ABoNT).

ЕД50 за показниками DAS для препарату IBoNT становив 11,6 ОД/кг, тобто ефективність була трохи меншою, ніж для NBoNT та OBoNT. ABoNT мав найнижчу ефективність (20,9 ОД/кг), але при індексі перерахунку дози 1:3 його ефективність була трохи вищою, ніж у препарату OBoNT. Визначення ЛД50 за показниками DAS при внутрішньом’язовому введенні IBoNT було неможливим, оскільки летальність становила <50% при максимальній дозі 100 ОД/кг. ЛД50 за показниками DAS при внутрішньом’язовому введенні становила 59,7 ОД/кг для OBoNT та NBoNT, і 179,1 ОД/кг для ABoNT. Значних відмінностей між препаратами за індексами безпеки не встановлено (7,2 для OBoNT, 8,4 для NBoNT та 8,6 для ABoNT).

Обговорення

Препарати ботулотоксину типу А, наявні на ринку, відрізняються методами очищення та хімічним складом, що викликає занепокоєння щодо різних показників ефективності та властивостей.6,22 Нами було встановлено спільні та відмінні риси в плані ефективності препаратів залежно від дози та періоду після ведення препарату.

Під час порівняння препаратів OBoNT та ABoNT за показниками CMAP в процентному вираженні в місці ін’єкції на 4 день після введення препарату, показник ефективності ABoNT був значно вищім при використанні коефіцієнта перерахунку доз 1:3; (3,3 ОД/кг OBoNT проти 10 ОД/кг ABoNT та 10 ОД/кг OBoNT проти 30 ОД/кг AboNT). Після порівняння ЕД50 за показниками CMAP цих двох препаратів було визначено коефіцієнт перерахунку дози 1:2,6, що узгоджується з даними про те, що коефіцієнт 1:3 був занадто високим. Недавні дослідження з використанням DAS-аналізу, проведеного в ході експерименту на щурах, дані електроміографії лобових м’язів та антигідротична дія свідчать про те, що коефіцієнт перерахунку дози для OBoNT та ABoNT має бути менше ніж 1:3, і що бажане співвідношення має становити 1:2,5, що вже зазначалося раніше,5,6,8,23,24 але коли коефіцієнт перерахунку для OBoNT та ABoNT отримували на основі ТД20 за показниками CMAP, він становив 1:2,2, що було навіть нижче за 1:2,6. Це пояснює, чому діапазон значень індексу безпеки ABoNT є не таким широким. Це також свідчить про те, що, відповідно до висновків Сампайо та його колег, коефіцієнт перерахунку дози, який пов’язаний лише з ефективністю, не можна було використовувати для прогнозування побічних ефектів.25

Під час порівняння препаратів OBoNT та NBoNT на основі зменшення амплітуди CMAP, вираженого у відсотках від вихідного рівня на 4 день після ін’єкції, NBoNT продемонстрував значно вищу ефективність лише при дозі 3,3 Од/кг; при інших дозах різниці не спостерігалося.

ЕД50 за показниками CMAP становила 0,50 ОД/кг для обох препаратів. Індекс безпеки, розрахований на основі змін показників CMAP, виражених у відсотках, склав 110,3 для NBoNT, що було вище, ніж для препарату OBoNT (88,6). Індекс безпеки, розрахований за допомогою аналізу DAS, склав 8,4 для NBoNT, тобто був незначно вищим від індексу для OBoNT (7,2). Незважаючи на те, що лише незначна кількість досліджень проводилася для порівняння цих токсинів, в одному з таких досліджень, присвяченому вимірюванню м’язової сили у мишей, повідомлялося про подібну ефективність.9 Можливо, висновки про те, що коефіцієнт перерахунку доз становить 1:1, є надто поспішними, оскільки адекватних та належним чином проведених клінічних порівнянь не проводилося, однак виявилося, що ефективність препаратів OBoNT та NBoNT при застосуванні у мишей є однаковою. ЕД50 за показниками CMAP становила 0,50 ОД/кг для обох препаратів. Індекс безпеки, розрахований на основі змін показників CMAP, виражених у відсотках, склав 110,3 для NBoNT, що було вище, ніж для препарату OBoNT (88,6). Індекс безпеки, розрахований за допомогою аналізу DAS, склав 8,4 для NBoNT, тобто був незначно вищим від індексу для OBoNT (7,2). Незважаючи на те, що лише незначна кількість досліджень проводилася для порівняння цих токсинів, в одному з таких досліджень, присвяченому вимірюванню м’язової сили у мишей, повідомлялося про подібну ефективність.9 Можливо, висновки про те, що коефіцієнт перерахунку доз становить 1:1, є надто поспішними, оскільки адекватних та належним чином проведених клінічних порівнянь не проводилося, однак виявилося, що ефективність препаратів OBoNT та NBoNT при застосуванні у мишей є однаковою.

Щодо зміни виражених у відсотках показників CMAP на 4 день після ін’єкції, IBoNT виявився значно менш ефективним, ніж OBoNT, NBoNT та потрійна доза ABoNT у дозах 3,3 ОД/кг та 10 ОД/кг. ЕД50 за показниками CMAP становила 0,53 ОД/кг, тобто трохи вище від 0,50 ОД/кг, отриманих для OBoNT та NBoNT. Таким чином, коефіцієнта перерахунку дози для OBoNT та IBoNT склав 1:1,07. Індекс безпеки для IBoNT, отриманий на основі змін показників CMAP у відсотковому вираженні, становив 122,0, що є найвищим серед токсичних препаратів. Чотири з семи мишей у групі IBoNT з найвищою дозою (100 ОД/кг) залишилися живими до кінця дослідження. Таким чином, хоча препарат IBoNT вважається менш ефективним, ніж інші, при його застосуванні виникає найменше побічних дій. Результати порівняльних досліджень, присвячених вивченню впливу препаратів на короткий розгинач пальців у здорових добровольців, свідчать про ефективність та тривалість дії OBoNT та IBoNT, хоча біологічні дослідження активності препаратів, проведені шляхом експерименту на мишах, показали, що активність препарату IBoNT була меншою, ніж OBoNT.3,4 Результати, отримані під час нашого дослідження, свідчать про те, що коефіцієнт перерахунку дози для препаратів OBoNT та IBoNT може бути дещо більшим, ніж 1:1, і що активність препарату IBoNT може бути трохи меншою, ніж активність OBoNT.

Незважаючи на те, що ефективність токсинів у дозах 3,3 та 10,0 ОД/кг була суттєво різною, значної різниці у зміні показників CMAP, виражених у відсотках, при низьких дозах (0,3 та 1,0 ОД/кг) не спостерігалося.

Отже, показники ефективності при застосуванні низьких доз можуть відрізнятися під час клінічного застосування, оскільки результати, отримані при введенні цих доз, були різними.

У попередніх дослідженнях, проведених на мишах, ЕД50 за показниками DAS-аналізу для OBoNT становила 3,5, 6 або 2 ОД/кг.13,26 Було визначено ЕД50 за показниками CMAP, що становить 0,50 ОД/кг, і було зроблено висновок, що різні визначення, встановлені для ЕД50 за показниками CMAP та ЕД50 за показниками DAS, стали причиною розриву між ЕД50 за показниками CMAP та ЕД50 за показниками DAS. ЕД50 за показниками DAS визначалася як доза, що призводить до результату 2 в ході аналізу DAS (стопа розслаблена, кінчики всіх пальців розведені, або три пальці торкаються один одного) протягом періоду пік-ефекту після ін’єкції токсину, а ЕД50 за показниками CMAP – як доза, при якій амплітуда CMAP зменшувалася на 50% протягом періоду пік-ефекту. Під час DAS-аналізу оцінюється пальцеве відведення після ін’єкції ботулотоксину в литковий м’яз. Відомо, що DAS-аналіз є відтворюваним і має високу ступінь узгодженості висновків дослідників,13 але оскільки під час дослідження оцінюється параліч м’язів відведення пальців, що прилягає до литкового м’язу, а не самого литкового м’язу, в який вводився препарат, результати локальної дифузії можуть братися до уваги, що може бути неправильно тлумачитися як ефективність. На відміну від цього, реєстрація показників CMAP у м’язі, в як було введено препарат, може бути кращим методом безпосередньої оцінки ефективності токсину. Було виявлено, що пік-ефект спостерігався протягом 2 – 4 днів після ін’єкції, про що було отримано дані згідно з DAS-аналізом або шляхом реєстрації амплітуди CMAP, хоча на основі аналізу DAS стан всіх мишей відновлювався до 56-го дня після ін’єкції. Тим не менше, виходячи з показників амплітуд CMAP, дія препарату, здавалося, тривала до 84-го дня після ін’єкції у групах, що отримували високу дозу. Крім того, хоча DAS-аналіз не продемонстрував ефекту парезу в групі з найменшими дозами, такі ефекти були спостерігалися навіть у цій групі шляхом реєстрації амплітуди CMAP. Це дозволяє припустити, що дані про зміну амплітуди CMAP є більш точними, ніж результати DAS-аналізу при кількісному визначенні дії ботулотоксину. Оскільки існує мало досліджень, в яких повідомляється про зменшення амплітуди CMAP залежно від різних доз, обмеження у визначенні ефективності із що свідчить про значну клінічну ефективність, встановлено певні застосуванням ЕД50 за даними CMAP. А втім, зміни амплітуди CMAP можуть бути кращим показником хімічної денервації, ніж результати DAS-аналізу, оскільки він оцінює безпосередньо м’яз, в який було введено препарат, виражає результати в чисельній формі і є більш точним.15,16

У цьому дослідженні було встановлено різницю у значеннях індексу безпеки, отриманих при визначенні CMAP та в ході аналізу DAS: 88,6 за показниками CMAP та 7,2 за результатами DAS-аналізу для OBoNT та 75,49 за показниками CMAP та 8,6 за даними DAS-аналізу для ABoNT. Індекс безпеки у препарату OBoNT був вищим, ніж у ABoNT відповідно до результатів виміру CMAP, але DAS-аналіз показав більш високий індекс безпеки при використанні препарату ABoNT. Різні визначення ТД20 за значеннями CMAP та ЛД50 за показниками DAS-аналізу при внутрішньом’язовому введенні, що використовуються для розрахунку індексу безпеки, можливо, також призвели до таких результатів. Під час порівняння індексів безпеки препаратів більш доцільним може стати застосування індексів безпеки, отриманих на підставі результатів щодо розслаблення м’язів, а не летальної дози.

Це дослідження проводилося на мишах для порівняння ефективності та токсичності чотирьох різних препаратів ботулотоксину, проте застосування результатів в клінічних умовах потребує обережності. Оскільки анатомія м’язів мишей відрізняється від людської, показники поглинання та розповсюдження ботулотоксину можуть також відрізнятися.8 Крім того, в ході цього дослідження використовувалися ЕД50 за показниками CMAP, ТД20 за показниками CMAP, ЕД50 за результатами DAS-аналізу та ЛД50 за результатами DAS-аналізу при внутрішньом’язовому введенні, отримані на підставі одного дослідження, що може обмежувати будь-яке узагальнення.

Що стосується ефективності, для препаратів OBoNT та ABoNT коефіцієнт перерахунку дози склав 1:2,6, тобто трохи нижче, ніж 1:3, відповідно до попередніх даних. Коефіцієнт перерахунку дози для препаратів OBoNT та NBoNT становив 1:1, а для OBoNT та

IboNT він дорівнював 1:1,07, що було трохи вище ніж 1:1, проте ці співвідношення базувались лише на показниках ефективності без урахування побічних ефектів і не повинні неправильно трактуватися як показники біоеквівалентності.

Посилання

1. Jankovic J, Brin MF. Therapeutic uses of botulinum toxin. N Engl J Med 1991;324:1186–94.

2. Brin MF. Development of future indications for BOTOX. Toxicon 2009;54:668–74.

3. Jost WH, Kohl A, Brinkmann S, Comes G. Efficacy and tolerability of a botulinum toxin type A free of complexing proteins (NT 201) compared with commercially available botulinum toxin type A (BOTOX) in healthy volunteers. J Neural Transm 2005;112:905–13.

4. Hunt T, Clarke K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin Neuropharmacol 2009;32:28–31.

5. Wohlfarth K, Schwandt I, Wegner F, Jrgens T, et al. Biological activity of two botulinum toxin type A complexes (Dysport and Botox) in volunteers: a double-blind, randomized, dose-ranging study. J Neurol 2008;255:1932–9.

6. Wohlfarth K, Sycha T, Ranoux D, Naver H, et al. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment? Curr Med Res Opin 2009;25:1573–84.

7. Wohlfarth K, Kampe K, Bigalke H. Pharmacokinetic properties of different formulations of botulinum neurotoxin type A. Mov Disord 2004;19(Suppl 8):S65–7.

8. Rosales RL, Bigalke H, Dressler D. Pharmacology of botulinum toxin: differences between type A preparations. Eur J Neurol 2006;13(Suppl 1):S2–10.

9. Stone AV, Ma J, Whitlock PW, Koman LA, et al. Effects of Botox and Neuronox on muscle force generation in mice. J Orthop Res 2007;25:1658–64.

10. Aoki KR. Botulinum neurotoxin serotypes A and B preparations have different safety margins in preclinical models of muscle weakening efficacy and systemic safety. Toxicon 2002;40:923–8.

11. Wohlfarth K, Mller C, Sassin I, Comes G, et al. Neurophysiological double-blind trial of a botulinum neurotoxin type A free of complexing proteins. Clin Neuropharmacol 2007;30:86–94.

12. Ranoux D, Gury C, Fondarai J, Mas JL, et al. Respective potencies of Botox and Dysport: a double blind, randomized, crossover study in cervical dystonia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002;72:459–62.

13. Aoki KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A, B, and Finmice. Toxicon2001;39:1815–20.

14. Hallis B, James BA, Shone CC. Development of novel assays for botulinum type A and B neurotoxins based on their endopeptidase activities. J Clin Microbiol 1996;34:1934–8.

15. Torii Y, Goto Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of biological activity of botulinum toxins utilizing compound muscle action potentials (CMAP), and comparison of neuromuscular transmission blockage and muscle flaccidity among toxins. Toxicon 2010;55:407–14.

16. Sakamoto T, Torii Y, Takahashi M, Ishida S, etal. Quantitative determination of the biological activity of botulinum toxin type A by measuring the compound muscle action potential (CMAP) in rats. Toxicon 2009;54:857–61.

17. Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD. Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 1994;128:69–77.

18. Bigalke H, Wohlfarth K, Irmer A, Dengler R. Botulinum A toxin: Dysport improvement of biological availability. Exp Neurol 2001;168:162–70.

19. Yoneda S, Shimazawa M, Kato M, Nonoyama A, et al. Comparison of the therapeutic indexes of different molecular forms of botulinum toxin type A. Eur J Pharmacol 2005;508: 223–9.

20. Cichon JV, McCaffrey TV, Litchy WJ, Knops JL. The effect of botulinum toxin type A injection on compound muscle action potential in an in vivo rat model. Laryngoscope 1995;105:144–8.

21. Osuchowski MF, Teener J, Remick D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve 2009;40:610–6.

22. Aoki KR, Ranoux D, Wissel J. Using translational medicine to understand clinical differences between botulinum toxin formulations. Eur J Neurol 2006;13(Suppl 4): S10–9.

23. Karsai S, Adrian R, Hammes S, Thimm J, et al. A randomized double-blind study of the effect of Botox and Dysport/Reloxin on forehead wrinkles and electromyographic activity. Arch Dermatol 2007;143:1447–9.

24. Hexsel D, Dal’Forno T, Hexsel C, Do Prado DZ, et al. A randomized pilot study comparing the action halos of two commercial preparations of botulinum toxin type A. Dermatol Surg 2008;34:52–9.

25. Sampaio C, Costa J, Ferreira JJ. Clinical comparability of marketed formulations of botulinum toxin. Mov Disord 2004;19 (Suppl 8): S129–36.

26. Aoki KR. Preclinical update on BOTOX ® (botulinum toxin type A)-purified neurotoxin complex relative to other botulinum neurotoxin preparations. Eur J Neurol 1999;6(Suppl 4): S3–10.

Address correspondence and reprint requests to: Joo Hyun Park, MD, PhD, Department of Rehabilitation Medicine, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, Catholic University of Korea, #505 Banpo-Dong, Seocho-Gu, Seoul 137–701, Korea, ore-mail: drpjh@catholic.ac.kr