Новий ботулінічний токсин, потенційна біоеквівалентність препарату онаботулінумтоксинa: чи існують відмінності між препаратами?

ОРИГІНАЛЬНА СТАТТЯ (завантажити статтю)

Автори: GI-HYEOK YANG, PHD, та HYUN HO JUNG, PHD*

Ботулоксини відносяться до групи білків, до якої входять сім різних серотипів (A-G), що продукуються різними штамами бактерій Clostridium botulinum, природними анаеробними еубактеріями, які утворюють ендоспори.1 Існує більше шести продуктів ботулотоксину, доступних на ринку: онаботулінумтоксинA (БОТОКС, “Аллерган, Інк.” (Allergan Inc.), Ірвайн, Каліфорнія), BTXA (Інститут біологічних продуктів Ланьчжоу, Китай), абоботулінумтоксинA (Диспорт, “Іпсен Лімітед” (Ipsen Limited.), Рексем, Великобританія), римаботулінумтоксинB (Нейроблок, “Сольстіс Ньюросайнсез” (Solstice Neurosciences), Луїсвілл, Кентуккі), Нейронокс (nue-BoNT/A “Медитокс, Інк.” (Medytox Inc.), Чхонвон, Корея) та інкоботулінумтоксинA (Ксеомін, “Мерц Фармасьютікалз” (Merz Pharmaceuticals), Франкфурт-на-Майні, Німеччина).

Ці препарати можна поділити на три групи залежно від їх серотипу та молекулярної природи: токсини серотипу А (онаботулінумтоксинA, абоботутулінумтоксинA, BTXA та neu-BoNT/A), токсини, що не містять серотипу А (інкоботулінумтоксинА), та токсини серотипу B (римаботулінумтоксинB; таблиця 1).2-7

З перелічених препаратів онаботулінумтоксинA є найбільш широко відомим і переважає на ринку ботулінічних токсинів, оскільки його вперше було схвалено та виведено на ринок у США в 1989 році. АбоботулінумтоксинА посідає друге місце на ринку токсинів і продається в Європі, Азії, Латинській Америці та в Сполучених Штатах, оскільки Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів (FDA) ухвалило його використання для лікування цервікальної дистонії та сильно виражених глабелярних зморшок у 2009 році. Вперше інкоботулінумтоксинA був представлений на ринку в Німеччині в 2005 році і став доступним в США. Порівнюваність цих продуктів, а надто препаратів онаботулінумтоксинА та абоботутулінумтоксинА, є предметом суперечок протягом останніх двох десятиліть, головним чином через різні характеристики, такі як молекулярна маса, допоміжна речовина та показники ефективності. Хоча те, яким чином ці відмінності можуть вплинути на клінічну ефективність та безпеку препаратів, все ще залишається предметом дискусій, було загальновизнано, що ці два препарати ботулотоксину не є взаємозамінними.

Від початку Neu-BoNT/A був розроблений з метою отримання характеристик, близьких до характеристик препарату онаботулінумтоксинA. Як і в випадку багатьох інших біоподібних препаратів, мета розробки полягала у створенні надійної альтернативи, що дозволила б знизити вартість лікування і яку лікарі могли б легко використовувати, не плутаючи дозування та не турбуючись про безпеку. Після більш ніж 6 років досліджень, зокрема на розробки програм для збереження зіставності препаратів, neu-BoNT/A був ухвалений для лікування блефароспазму в Південній Кореї в 2006 році. Він став одним з найбільш популярних продуктів ботулотоксину, доступних в країнах Азії та Латинської Америки, таких як Південна Корея, Японія, Таїланд та Бразилія для лікування та в косметичних цілях.

В статті розглядаються наукові дані щодо зіставності препаратів онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A.

Порівняння мікробіологічних, фізико-хімічних та біохімічних профілів: ОнаботулінумтоксинА та neu-BoNT/A

Враховуючи, що ботулотоксин є біологічним агентом, що утворюється в живих клітинах, слід ретельно розглянути походження штамів бактерій. Компанія “Медитокс Інк.” використовує Clostridium botulinum тип А штам Hall, тобто той же штам, що й компанія “Аллерган”. Була проаналізовано результати секвенування ДНК комплексу токсину типу А, зокрема всі нетоксичні компоненти, а також сам токсин (номер доступу GeneBank DQ409059). Виведена амінокислотна послідовність препарату neu-BoNT/A узгоджувалася з даними компанії “Аллерган”, опублікованими в 2003 р.,8 і відмінностей між амінокислотними послідовностями двох препаратів знайдено не було (дані не наведені). Отже, препарати, які виробляють компанії “Аллерган” з C. botulinum типу A Hall (AF488749, 488748, 488747, AF488746, AF488745) та “Медитокс”(DQ409059), по суті походять від того самого штаму, який використовується для виробництва комплексу ботулотоксину типу A.

Ботулотоксин, вироблений з використанням бактерії C. botulinum, представляє собою очищену культуральну рідину. Оскільки методи, що застосовуються для культивування та очищення, є конфіденційною інформацією виробників, публікації щодо них відсутні. Тому неможливо безпосередньо порівняти виробничі процеси, але молекулярна маса комплексу токсину кінцевого балк-матеріалу, на який вплинуть такі процеси, була в центрі дискусій протягом останніх двох десятиліть, що точилися навколо теми порівняння різних препаратів. Деякі стверджують, що онаботулінумтоксинА є однорідним комплексом токсину 900 кДа, тоді як абоботулінумтоксинА являє собою суміш комплексів 500 і 900 кДа.9 Такі відмінності в молекулярній масі можуть бути причиною різниці в моделях дифузії або поширення в тканини навколо місця ін’єкції.10,11

Хоча наслідки різних молекулярних мас є суперечливими, а клінічне значення молекулярної маси незрозуміле, було прийнято рішення про розробку гомогенного комплексу токсинів 900 кДа. Оскільки в одному флаконі комерційного препарату ботулінового токсину міститься лише кілька нанограмм комплексу токсину (із приблизно в 10000 разів більшою кількістю сироваткового альбуміну людини), вилучити комплекс токсинів із флаконів неможливо. Таким чином, структуру цих продуктів неможливо безпосередньо порівняти. Натомість було проведено аналіз препарату neu-BoNT/A з використанням високо- ефективної витісної рідинної хроматографії (SE-HPLC) із сумішшю стандартів молекулярної маси, в результаті чого був отриманий одиничний пік на хроматограмі, що відображає його однорідність (рис.1). Молекулярна маса комплексу токсину була визначена шляхом порівняння з калібрувальною кривою, побудованою на основі показників. Середня молекулярна маса 10 партій балк-матеріалу становила 904 ± 7 кДа, що наближається до молекулярної маси комплексу токсину балк-матеріалу. Ці дані отримала група дослідників компанії “Аллерган”: 880 кДа за результатами SE-HPLC та 925 ± 45 кДа за результатами аналізу світлорозсіювання.12

Досі не встановлено, чи молекулярна маса комплексу токсину значним чином корелює з небажаною дифузією або поширенням препарату ботулотоксину.

А втім, з теоретичної точки зору можна було б стверджувати, що, оскільки онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A подібні за розмірами молекули, їх дифузійні структури теж подібні.

Незважаючи на різний склад препаратів ботулотоксину, сироватковий альбумін людини (HSA) використовується як допоміжна речовина у всіх препаратах, за винятком китайського BTXA, в якому замість альбуміну використовується желатин (таблиця 1). Флакон neu-BoNT/A 100-U, як і флакон онаботулінумтоксинA 100-U, містить 100 ОД очищеного токсинного комплексу, 0,9 мг хлориду натрію та 0,5 мг HSA. АбоботулінумтоксинA має менший вміст HSA (0,125 мг) і містить 2,5 мг лактози у флаконі 500 ОД (упаковка Диспорт). (У Сполучених Штатах абоботулінумтоксинA доступний у флаконі по 300 ОД). ІнкоботулінумтоксинA містить 1,0 мг HSA та 5 мг сахарози у флаконі по 100 ОД. Склад препарату римаботулінумтоксинВ також відрізняється від інших: 0,5 мг HSA, 5,844 мг хлориду натрію та 1,621 мг сукцинату натрію13 (упаковка Нейроблок). Незважаючи на те, що досі незрозуміло, чи можуть різні допоміжні речовини впливати на клінічні результати, існують певні дані, що вказують на можливий вплив сироваткового альбуміну людини на біологічну доступність ботулотоксину.14 Оскільки препарат neu-BoNT/A має такий же склад, що й онаботулінумтоксинA, різниці в дії допоміжних речовин цих препаратів не існувало б.

Рисунок 1. Хроматограма, отримана в результаті високоефективної витісної рідинної хроматографії для очищеного комплексу ботулотоксину типу А, виконаної з використанням ексклюзійної колонки Shodex Protein KW-804 (внутрішній діаметр 8,0 мм х довжина 300 мм, розмір частинок 7 пм). Елюйований зразок пройшов контроль при поглинанні ультрафіолету з довжиною хвилі 278 нм.

Наведені вище докази дозволяють зробити припущення, що дія препарату neu-BoNT/A буде клінічно подібною до дії препарату онаботулінумтоксинA, оскільки він має той самий штам C. botulinum, аналогічний розмір комплексу токсину та однакові інгредієнти у флаконі.

Доклінічні дані щодо порівнянності, отримані на основі фармакодинамічних моделей

Перед обговоренням можливості клінічного використання neu-BoNT/A необхідно розглянути інші питання. Основним питанням є ефективність препарату neu-BoNT/A. Одна одиниця ботулотоксину зазвичай відповідає розрахованій середній летальній дозі (LD50) при внутрішньоочеревинному введенні у мишей. Пряме порівняльне дослідження кількох партій препарату онаботулінумтоксин A та еталонних партій препарату neu-BoNT/A, проведене шляхом кількісного визначення діючої речовини в умовах in vivo свідчить про те, що в умовах in vivo активність двох препаратів є практично однаковою (таблиця 2). Однак оскільки методи проведення аналізу в кожного виробника різні (тип середовища-носія, схема розведення, лабораторні протоколи), порівняти біологічну активність одиниць досить важко, не кажучи вже про перерахунок доз.15,16 Таким чином було проведено кілька фармакодинамічних досліджень для порівняння біологічної активності двох зазначених вище препаратів.

Для оцінки фармакологічної активності ботулінічних токсинів у нервово-м’язовому синапсі використовують кілька методів дослідження на тваринній моделі. Перший метод, визначення сумарного потенціалу м’язової дії (CMAP), представляє собою електрофізіологічне визначення функції м’язів. Мікроструми, що генеруються при скороченні м’язів, посилюються та реєструються, і таким чином дозволяють кількісно визначити ступінь пригнічення вивільнення ацетилхоліну в нервово-м’язовому з’єднанні.17,18 Другий метод, аналіз впливу на нервово-м’язову передачу (DAS, пальцеве відведення), модифікований Аокі та колегами,19,20 представляє собою вербальну шкалу, що використовується для оцінки ступеня вогнищевої слабкості в результаті хімічної денервації, спричиненої введенням токсину в задню кінцівку. У цій моделі доклінічних досліджень коефіцієнти безпеки можуть бути розраховані на основі співвідношення між середньою ефективною дозою (ЕД50; ступінь фокального ослаблення) та ЛД50 (системна дифузія після внутрішньом’язового введення токсину). Третій метод, модель генерації м’язової сили, що включає дослідження функцій задньої кінцівки щурів, може використовуватися для оцінки багатьох параметрів, зокрема зменшення генерації м’язової сили та потенційної дифузії токсину в контралатеральну кінцівку. Всі три описані вище моделі також дозволяють оцінити тривалість дії препаратів та час відновлення.

Взаємозв’язок доза-відповідь для препаратів онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A в частині інгібування м’язового зусилля вперше був продемонстрований на модельних мишах, а час відновлення визначався на основі паралічу м’язів, спричиненого дією токсину. Дія зазначених препаратів призвела до еквівалентних відповідей.21 Нещодавно було завершено порівняльне дослідження препаратів neu-BoNT/A, онаботулінумтоксин A, абоботулінумтоксинA та інкоботулінумтоксинA з використанням методу CMAP на модельних мишах. Коефіцієнт перерахунку доз для препаратів онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A склав 1:1 (Чанг М.Е., особисте повідомлення). Був також проведений порівняльний аналіз препаратів онаботулінумтоксинA, абоботулінумтоксинA та neu-BoNT/A із застосуванням моделі DAS (С.Б. Kim та ін., Стендова доповідь, представлена на конференції “Токсини 2008”, Бавено, Італія). Відповідно до попередніх досліджень, всі параметри, включаючи ЕД50, ЛД50 та коефіцієнт безпеки виявилися зіставними, що свідчить про подібність препаратів онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A, принаймні на стадії доклінічних випробувань на тваринах.

Було проведено сім незалежних експериментів із використанням трьох різних партій ботоксу та neu-BoNT/A. * Для вимірювання біологічної активності препаратів застосовували кількісне визначення діючою речовини на основі розрахунку летальної дози для мишей на підприємстві “Медитокс”. (1 ОД = 1 середня летальна доза для мишей).

Порівняльні клінічні дослідження

Виходячи з наявних на сьогодні даних, можна стверджувати, що 1 ОД препарату онаботулінумтоксинА відповідає 2-5 ОД препарату абоболутулінумтоксинА.22,23 Незважаючи наявність досліджень, в яких повідомляється, що інкоботулінумтоксинА взаємозамінний з препаратом онаботулінумтоксинА24,25 інші стверджують, що інкоботулінумтоксинА менш ефективний, ніж онаботулінумтоксинА.20,26

Оскільки neu-BoNT/A був нещодавно представлений на ринку, на сьогодні немає достатньої кількості результатів досліджень, висвітлених в літературі. Подвійне сліпе рандомізоване порівняльне дослідження препаратів “Нейронокс” (вітчизняна торгова марка neu-BoNT/A) та онаботулінумтоксинA при лікуванні есенціального блефароспазму 27 дозволило дійти висновку, що між двома групами пацієнтів не було визначено суттєвих відмінностей щодо ефективності (тяжкість спазмів, зміни в силі змикання повік, функцій зору) або безпеки при коефіцієнті перерахунку дози 1:1. Інше рандомізоване подвійне сліпе лацебо-контрольоване багатоцентрове клінічне дослідження, в ході якого порівнювалася дія репаратів онаботулінумтоксинA та neu-BoNT/A, показало, що препарат neu-BoNT/A є так само ефективним та безпечним, як і онаботулінумтоксинA при лікуванні спастичності у дітей з ДЦП.28 Подвійне сліпе рандомізоване порівняльне дослідження ефективності лікування глабелярних зморшок також продемонструвало зіставну ефективність та безпеку препаратів neu-BoNT/A та онаботулінумтоксинA при коефіцієнті перерахунку дози 1:1, що узгоджується з результатами досліджень на тваринах (Ц.Г. Вон. Неопубліковані дані).

Висновки

На світовому ринку представлені більше п’яти препаратів ботулотоксину типу А. ОнаботулінумтоксинA, абоботулінумтоксин A та інкоботулінумтоксинA були ухвалені Управлінням з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів для використання в терапевтичних та косметичних цілях. Незважаючи на необхідність проведення більш масштабних досліджень щодо безпеки при тривалому використанні препаратів та додаткових порівняльних клінічних досліджень щодо застосування в різних цілях, препарат neu-BoNT/A видається подібним до препарату онаботулінумтоксинA відповідно до результатів попередніх досліджень у кількох різних областях (офтальмологія, неврологія та естетична медицина). Тому можна очікувати, що ці препарати конкуруватимуть на ринках, на яких вони представлені.

Посилання

1. Oguma K, Fujinaga Y, Inoue K. Clostridium botulinum toxin. Toxin Rev 1997;16(4):253–66.

2. Jankovic J, Vuong KD, Ahsan J. Comparison of efficacy and immunogenicity of original versus current botulinum toxin in cervical dystonia. Neurology 2003;60(7):1186–8.

3. Setler P. The biochemistry of botulinum toxin type B. Neurology 2000;55(12 Suppl 5):S22–8.

4. Dressler D, Benecke R. Xeomin®: perspektiven einer neuen therapeutischen Botulinumtoxinpr€aparation. Aktuelle Neurologie 2006;33(3):138–41.

5. Dressler D. Complete secondary botulinum toxin therapy failure in blepharospasm. J Neurol 2000;247(10):809–10.

6. Carruthers A, Carruthers J. Botulinum toxin products overview. Skin Therapy Lett 2008;13(6):1–4.

7. Pickett A, Panjwani N, O’Keeffe R. Potency of type A botulinum toxin preparaions in clinical use. 40th annual meeting of the interagency botulinum research coordinating committee (IBRCC). Atlanta, USA; 2003.

8. Zhang L, Lin W-J, Li S, Aoki KR. Complete DNA sequences of the botulinum neurotoxin complex of Clostridium botulinum type A-Hall (Allergan) strain. Gene 2003;315:21–32.

9. Wenzel R, Jones D, Borrego JA. Comparing two botulinum toxin type A formulations using manufacturers’ product summaries. J Clin Pharm Ther 2007;32(4):387–402.

10. Frevert J, Dressler D. Complexing proteins in botulinum toxin type A drugs: a help or a hindrance? Biologics 2010;4:325–32.

11. Trindade de Almeida AR, Marques E, De Almeida J, Cunha T, et al. Pilot study comparing the diffusion of two formulations of botulinum toxin type A in patients with forehead hyperhidrosis. Dermatol Surg 2007 ;33(1 Spec No.):S37–43.

12. Lietzow MA, Gielow ET, Le D, Zhang J, et al. Subunit stoichiometry of the Clostridium botulinum type A neurotoxin complex determined using denaturing capillary electrophoresis. Protein J 2008;27(7–8):420–5.

13. Xeomin (SPC) Drugs.com [Internet]. Available from: http://www.drugs.com/uk/xeomin-spc-8243.ht ml cited June 28, 2011.

14. Bigalke H, Wohlfarth K, Irmer A, Dengler R. Botulinum A toxin: Dysport improvement of biological availability. Exp Neurol 2001;168(1):162–70.

15. Sesardic D, Leung T, Gaines Das R. Role for standards in assays of botulinum toxins: international collaborative study of three preparations of botulinum type A toxin. Biologicals 2003;31 (4):265–76.

16. Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD. Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 1994;128(1):69–77.

17. Sakamoto T, Torii Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of the biological activity of botulinum toxin type A by measuring the compound muscle action potential (CMAP) in rats. Toxicon 2009;54(6):857–61.

18. Torii Y, Goto Y, Takahashi M, Ishida S, et al. Quantitative determination of biological activity of botulinum toxins utilizing compound muscle action potentials (CMAP), and comparison of neuromuscular transmission blockage and muscle flaccidity among toxins. Toxicon 2010;3:407–14.

19. Aoki KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon 2001;39 (12):1815–20.

20. Aoki KR. Botulinum neurotoxin serotypes A and B preparations have different safety margins in preclinical models of muscle weakening efficacy and systemic safety. Toxicon 2002;40(7): 923–928.

21. Stone AV, Ma J, Whitlock PW, Koman LA, et al. Effects of Botox and Neuronox on muscle force generation in mice. J Orthop Res 2007;25(12):1658–64.

22. Brashear A. Clinical comparisons of botulinum neurotoxin formulations. Neurologist 2008;14(5):289–98.

23. Sampaio C, Costa J, Ferreira JJ. Clinical comparability of marketed formulations of botulinum toxin. Mov Disord 2004;19 (Suppl 8):S129–36.

24. Jost WH, Kohl A, Brinkmann S, Comes G. Efficacy and tolerability of a botulinum toxin type A free of complexing proteins (NT 201) compared with commercially available botulinum toxin type A (BOTOX) in healthy volunteers. J Neural Transm 2005;112(7):905–13.

25. Hunt T, Clarke K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin Neuropharmacol 2009;32(1):28–31.

26. Wohlfarth K, M€uller C, Sassin I, Comes G, et al. Neurophysiological double-blind trial of a botulinum neurotoxin type a free of complexing proteins. Clin Neuropharmacol 2007;30(2):86–94.

27. Yoon JS, Kim JC, Lee SY. Double-blind, randomized, comparative study of Meditoxin versus Botox in the treatment of essential blepharospasm. Korean J Ophthal 2009;23(3):137–41.

28. Kim K, Shin H-I, Kwon BS, Kim SJ, et al. Neuronox versus BOTOX for spastic equinus gait in children with cerebral palsy: a randomized, double-blinded, controlled multicentre clinical trial. Dev Med Child Neurol 2011;53(3):239–44.

Address correspondence and reprint requests to: Gi-Hyeok Yang, PhD, Microbial Toxin R&D Center, Ochang Science Industry Complex 641–4, Gak-ri, Ochang-eup, Cheongwon-gun, Chungbuk 366–883, Korea, or e-mail: yanggh@medy-tox.co.kr