Выберите язык:

Экспериментальные доказательства влияния инъекционного препарата Meso-Xanthin F199™ на меланогенез

Скачать статью

Авторы:

Морозов С.Г.
д.м.н., член-корреспондент РАН, ВРИО директора по науке ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАН

Волкова Е.Н.
д.м.н., профессор, директор научно-образовательного департамента Premierpharm

Григорьева А.А.
врач-косметолог, сертифицированный тренер Premierpharm

Берзегова Л.В.
к.м.н., врач-косметолог, ведущий спикер Premierpharm

Кожина К.В.
врач-косметолог, сертифицированный тренер Premierpharm

 

Известно, что выделяют два основных механизма старения кожи: фотостарение, вызванное воздействием ультрафиолета (УФ) и хронологическое (возрастное) старение.

Фотостарение сопровождается появлением глубоких морщин, пигментных пятен, изменением цветности, дряблостью, сухостью кожи, атрофией, эластозом и актинической пурпурой. В основе этих изменений лежит увеличение синтеза активных форм кислорода (АФК). АФК повышают уровень пептида-активатора 1, стимулирующего активность матричных металлопротеиназ, что приводит к разрушению коллагена. В то же время АФК снижают содержание фактора роста TGF-β2, отвечающего за синтез нового коллагена. Таким образом, при старении кожи развивается дисбаланс белков внеклеточного матрикса эпидермиса.

Одним из защитных механизмов кожи против воздействий УФ является активная продукция меланина и перенос его из меланоцитов в кератиноциты с помощью меланосом. Меланин препятствует проникновению УФ в глубокие слои кожи и блокирует выброс АФК.

Процессы нарушения пигментации кожи, связанные и не связанные с возрастными изменениями, могут быть обусловлены внутренними факторами (такими как генетические особенности организма, гормональные изменения, клеточный метаболизм) и внешними факторами (хроническое облучение кожи ультрафиолетом, ионизирующее излучение, химические вещества и токсины).

Поддержание постоянной пигментации кожи – сложный процесс, включающий много этапов и зависящий от многих параметров: миграции меланобластов в ткань в течение эмбриогенеза, их жизнеспособности и дифференцировки в меланоциты, плотности меланоцитов в коже, экспрессии и функций энзиматических и структурных компонентов меланосом, синтеза различных типов меланина (эу- и феомеланина), созревания и транспортировки меланосом в дендритные отростки меланоцитов и переноса их в кератиноциты, и, наконец, распространения меланина в супрабазальных слоях кожи.

Нарушение регуляции любого из этапов синтеза меланина может привести к потере пигментации, формированию участка кожи измененного цвета, появлению пигментных пятен и опухолей. Основным фактором, влияющим на меланогенез, является УФ, который активирует УФ-чувствительные белки, стимулирующие избыточный синтез меланина. Но, независимо от эндогенной или экзогенной природы сигнала, активируется рецептор-1 к меланокортину – главный пусковой механизм меланогенеза. После его активации увеличивается экспрессия основного регулятора меланогенеза – мастера транскрипционной регуляции пигментации – MITF. Его контролирует фактор Sox10. MITF запускает экспрессию тирозина – фермента, контролирующего синтез меланина. Также MITF запускает экспрессию gp100 – фактора, регулирующего созревание меланосом и синтез эумеланина – пигмента черного цвета (рис. 1).

Для подавления гиперпигментации и аномального меланогенеза требуется применение комбинированных препаратов, способных оказать воздействие на разных этапах и уровнях регуляции синтеза меланина. Таким препаратом является Meso-Xanthin F199™, который активно применяется для эффективного решения различных эстетических проблем кожи, связанных с дисхромией.

Состав препарата Meso-Xanthin F199™

Ключевой компонент препарата – каротиноид Фукоксантин F-199 (Fucoxanthin F-199) обладает мощным эффектом воздействия на репарацию ДНК стволовых и специализированных клеток, поврежденных в условиях оксидативного стресса, при фотоповреждении и в процессе хроностарения.

Известно, что фукоксантин оказывает защитное действие при различных патологиях. В частности, установлено, что после УФ-воздействия на мышей, фукоксантин ингибирует тирозинкиназу и снижает экспрессию мРНК MCR1 и тирозиназ-зависимого рецептора 1.

Кроме того, в состав инъекционного препарата Meso-Xanthin F199™ входят антиоксиданты, снижающие уровень АФК в коже; тиоредоксин, восстанавливающий окислительно-восстановительный баланс в меланосомах и переключающий синтез с эумеланина на феомеланин; витамин А, ингибирующий УФ-индуцированный меланогенез; а также другие факторы, способствующие восстановлению и поддержанию гомеостаза кожи.

Эффективность препарата MesoXanthin F199™

Для изучения in vitro эффективности и механизмов действия комбинированных препаратов в настоящее время используют первичные культуры меланоцитов и кератиноцитов и тканевые эквиваленты Меланодерм.

Такой подход позволяет оценить биоэффективность и безопасность различных препаратов, провести анализ их молекулярных мишеней и прогнозировать вероятные последствия воздействия. Для оценки эффективности препарата Meso-Xanthin F199™ в Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАН (Москва) и Российской медицинской Академии последипломного образования Минздрава РФ (Москва) были проведены эксперименты с добавлением этого инъекционного препарата к органотипической культуре Меланодерм и культуре из меланоцитов кожи человека (рис. 2). Выбранные объекты позволили объективно оценить степень воздействия Meso-Xanthin F199™ на различные этапы меланогенеза.

 

 

Рис. 1. Влияние УФ на меланогенез (John A. D’Orazio, Stuart Jarrett, Amanda Marsch, James Lagrew and Laura Cleary /Recent Advances in the Biology, Therapy and Management of Melanoma (2013)

Рис. 2. Эксперименты на 3D-моделях тканевых эквивалентов Меланодерм и сфероидах из меланоцитов, проведенные в Научноисследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАН (Москва) и Российской медицинской Академии последипломного образования Минздрава РФ (Москва)

Материалы и методы

Органотипическая культура была представлена тканевыми эквивалентами. Образцы для тестирования получали следующим образом: в планшет для культивирования помещалась специальная вставка для культивирования с пористой мембраной. На мембрану в дальнейшем послойно наносили разные типы клеток в необходимом соотношении. В соответствии с протоколом образцы инкубировали до образования межклеточных связей и формирования базальной мембраны.

Результаты и обсуждение

Результаты эксперимента на образцах Меланодерм (при добавлении Meso-Xanthin F199™ и без него) можно оценить даже визуально благодаря накоплению пигмента и потемнению образцов. На рис. 3 видно, как в процессе культивирования потемнели контрольные образцы (без MesoXanthin F199™) по сравнению с исследуемыми образцами (с Meso-Xanthin F199™).

Рис. 3. Накопление пигмента в тканевых эквивалентах Меланодерм (фотографии высушенных образцов перед спектрофотометрией)

В результате спектрофотометрического анализа высушенных образцов было установлено, что к 7-м суткам концентрация меланина в контрольных образцах превышала концентрацию меланина в исследуемых образцах (рис. 4).

Возникает вопрос, почему вообще происходило потемнение? В соответствии с протоколом исследования использовалась готовая среда, стимулирующая меланогенез. В таких условиях невозможно его полное подавление, однако препарат Meso-Xanthin F199™ способствовал равномерному распределению пигмента в тканевом эквиваленте в отличие от контрольного образца, где пигмент распределен неравномерно.

Данные общего гистологического анализа тканевых эквивалентов Меланодерм показали, что в процессе культивирования в контрольной группе происходит увеличение толщины клеточного слоя меланоцитов (стрелки) (рис. 5). В экспериментальной группе толщина слоя меланоцитов к 7-м суткам культивирования увеличивалась незначительно (стрелки) (рис. 5). Это свидетельствует о том, что препарат Meso-Xanthin F199™ не подавляет пролиферацию меланоцитов.

Для дальнейшей оценки влияния Meso-Xanthin F199™ на экспрессию ключевых факторов меланогенеза: gp100, MITF, Sox10, MCR1 и TYR был проведен иммуноцитохимический анализ срезов тканевых эквивалентов Меланодерм.

В результате анализа было установлено, что в контрольной группе экспрессию MITF (мастер транскрипционной регуляции пигментации – основной регулятор меланогенеза) наблюдали уже в первые сутки культивирования, а к седьмым суткам ее выявляли во всем тканевом эквиваленте, тогда как в исследуемой группе (в присутствии MesoXanthin F199™) экспрессия данного транскрипционного фактора выявлялась только на третьи и незначительно увеличивалась к седьмым суткам (рис. 6)

Рис. 4. Спектрофотометрический анализ результатов эксперимента, проведенного на образцах Меланодерм, культивируемых вместе с инъекционным препаратом Meso-Xanthin F199 и без него (*р<0,05 в сравнении с контрольной группой)

Рис. 5. Гистологический анализ тканевых эквивалентов Меланодерм контрольной (А) и исследуемой (Б) групп на 1-е, 3-и и 7-е сутки культивирования (световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозин). Стрелками отмечены меланоциты

Рис. 6. Иммуноцитохимический анализ экспрессии MITF контрольной и исследуемой групп на срезах тканевых эквивалентов на 1-е, 3-и, 7-е сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий – ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный – MITF

Рис. 7. Иммуноцитохимический анализ экспрессии gp100 контрольной и исследуемой групп на срезах тканевых эквивалентов на 1-е, 3-и, 7-е сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий – ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный – gp100

Рис. 8. Иммуноцитохимический анализ экспрессии Sox10 контрольной и исследуемой групп на срезах тканевых эквивалентов на 1-е, 3-и, 7-е сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий – ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный – Sox10

Процесс меланогенеза происходит в меланосомах – внутриклеточных везикулярных органеллах, с помощью которых осуществляется дальнейший трансфер пигмента в кератиноциты. За полное созревание меланосом и синтез эумеланина ответственен белок gp100.

В результате иммуноцитохимического анализа было установлено, что уровень экспрессии gp100, отвечающего за созревание меланосом, снижен в исследуемой группе (в присутствии Meso-Xanthin F199™) по сравнению с контрольной на 1-е, 3-и и 7-е сутки культивирования (рис. 7).

Транскрипционный фактор Sox10 относится к ключевым «игрокам» клеточного метаболизма и регулирует множество внутриклеточных процессов, в том числе экспрессию фактора MITF, морфогенез и клеточную дифференцировку, подавляет апоптоз. Изменение экспрессии Sox10 может нарушить нормальное функционирование клетки и привести к развитию тяжелых патологических состояний. В результате анализа было установлено, что Meso-Xanthin F199™ не оказывает влияния на экспрессию Sox10 (рис. 8).

После проведенного иммуноцитохимического анализа было установлено, что Meso-Xanthin F199™ первостепенно влияет на экспрессию фактора созревания меланосом gp100 и, в меньшей степени, воздействует на экспрессию мастера транскрипции регуляции пигментации MITF и не влияет на транскрипционный фактор Sox10.

В ходе работы было установлено, что в исследуемых образцах экспрессия гена рецептора 1 к меланокортину (MCR1) была достоверно ниже, чем в контрольной группе на 7-е сутки культивирования. Экспрессия гена тирозиназы (TYR) практически полностью была подавлена в эксперименте на 7-е сутки культивирования в сравнении с контрольными образцами (рис. 9). Такое максимальное воздействие инъекционного препарата к последнему дню культивирования in vitro может свидетельствовать о накопительном эффекте.

Рис. 9. ПЦР-анализ тканевых эквивалентов Меланодерм. Метод ПЦР в реальном времени, RQ – относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену TBP (*р<0,05 в сравнении с другими разведениями на соответствующем пассаже)

Полученные данные свидетельствуют об избирательности воздействия Meso-Xanthin F199™ – он подавляет созревание меланосом и интенсивный синтез меланина, однако не блокирует основные пути меланогенеза, следовательно, не вызывает тяжелые патофизиологические осложнения.

Для подтверждения отсутствия токсичности и биобезопасности воздействия препарата Meso-Xanthin F199™ непосредственно на меланоциты, препарат добавляли в ростовую среду (в соотношении объемов: 1:10, 1:100, 1:1000), далее проводили исследование на жизнеспособность и пролиферативную активность меланоцитов. Клетки сохраняли свою жизнеспособность, морфологию, способность мигрировать и пролиферировать (рис. 10). Анализ поведения клеток выявил увеличение индекса пролиферации в исследуемой группе, к которой был добавлен инъекционный препарат Meso-Xanthin F199™ в максимальной концентрации (рис. 11).

Рис. 10. Динамика пролиферации в 2D-культуре. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия

Рис. 11. Гистограмма значений индекса пролиферации культуры меланоцитов на 3-м и 4-м пассажах в трех исследуемых (разведение препарата Meso-Xanthin F199™ 1:10, 1:50 и 1:100) и контрольной группах (*р<0,05 в сравнении с другими разведениями на соответствующем пассаже)

Рис. 12. Воздействие Meso-Xanthin F199™ на различных участников меланогенеза

И в заключение

В итоге в ходе исследования было установлено, что Meso-Xanthin F199™ стимулирует пролиферацию меланоцитов в культуре и не способствует увеличению числа дифференцированных меланоцитов в тканевых эквивалентах. Meso-Xanthin F199™ in vitro проявил себя как препарат с высокой биологической активностью: он снижает гиперчувствительность к сигналу, активирующему меланогенез; подавляет избыточный меланогенез через супрессию тирозиназы; регулирует экспрессию мастера транскрипционной регуляции меланогенеза MITF; препятствует созреванию меланосом и синтезу эумеланина через фактор gp100 (рис. 12).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат MesoXanthin F199™ является высокоэффективным и безопасным средством для коррекции меланогенетических пятен и дисхромий.

Подпишитесь на наши
обновления