Выберите язык:

Экспериментальное обоснование действия препарата Meso-Eye С71™ на активность воспаления

Скачать статью

Василий Ашапкин
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, НИИ физико-хими- ческой биологии им. А.Н. Белозерского, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Людмила Кутуева
младший научный сотрудник, НИИ физико- химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Елена Волкова
доктор медицинских наук, профессор, Директор Научно-образовательного Департамента Premierpharm

Борис Ванюшин
доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий отделом, НИИ физико-химической био- логии им. А.Н. Белозерского, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Лариса Берзегова
кандидат медицинских наук, врач- косметолог, ведущий спикер компании Premierpharm, сертифицированный тренер компании Premierpharm Анна ГРИГОРЬЕВА врач-косметолог, сертифицированный тренер компании Premierpharm

ВВЕДЕНИЕ

Гистологические исследования показывают, что причины возникновения темных кругов и мешков под глазами весьма разнообразны. Если эти проблемы более выражены утром, чем накануне вечером, это может указывать на усиление локального кровотока и повышение проницаемости сосудов. Как правило, подобные изменения являются результатом развития воспаления, которое представляет собой комплексную реакцию, направленную на потенциально вредных агентов, таких как микробы или поврежденные клетки (рис. 1). Воспалительный процесс, включающий реакцию сосудистой системы, миграцию и активизацию лейкоцитов, в целом направлен на уничтожение или изоляцию потенциально вредного агента и запуск необходимых процессов заживления и восстановления поврежденной ткани. Хотя воспаление представляет собой защитную реакцию, тесно связанную с репарацией тканей, нередко оно бывает потенциально вредным и даже опасным. Как можно видеть по его типичным проявлениям (покраснение, боль, жар, опухание и др.), воспаление часто бывает чрезмерно активным и агрессивным процессом. Проявлением различных воспалительных реакций является лимфангиогенез – процесс образования новых лимфатических сосудов (ЛС). В целом лимфатическая система самым непосредственным образом участвует в воспалительных реакциях и репаративных процессах. Одна из важнейших ее функций – транспорт лейкоцитов и растворимых антигенов из периферических тканей к лимфатическим узлам (ЛУ). Резидентные дендритные клетки (ДК) в соматических тканях захватывают антигены и мигрируют к лимфатическим узлам для их предъявления, но сами растворимые антигены достигают ЛУ быстрее, чем антиген-предъявляющие клетки (АПК). Предполагается, что таким способом лимфатические узлы «инструктируются» для встречи соответствующих АПК. Вены служат главным местом выхода лейкоцитов из кровотока в окружающие ткани при воспалительных ответах на проникновение инфекционных агентов и повреждение тканей.

По-видимому, особенности течения воспалительных ответов и скорость их разрешения в значительной степени определяются уровнем экспрессии генов, кодирующих хемокины и другие сигнальные молекулы воспаления в эндотелиальных клетках (ЭК) кровеносных и лимфатических сосудов. В настоящей статье исследовано влияние препарата MesoEye™ C71 на экспрессию таких генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали культивируемые эндотелиальные клетки HMVEC-D (human dermal microvascular endothelial cells), полученные из микрососудов кожи человека и представляющие собой смесь эндотелиальных клеток кровеносных и лимфатических сосудов (компания Lonza, CC-2543). После размораживания клетки культивировали на среде EGM-2 MV BulletKit (компания Lonza, CC-3202) при температуре 37о C в увлажненной атмосфере 5% CO2 в пластиковых чашках Петри в течение 2 пассажей. MesoEye C71™ добавляли к среде (из расчета 10 мкл на 1 мл среды) перед началом третьего пассажа и выращивали клетки до формирования монослоя. Контрольные клетки культивировали аналогично, но без добавления препарата. По окончании третьего пассажа среду удаляли, а к клеткам добавляли реагент RNA protect Cell Reagent (компания Qiagen, Германия), стабилизирующий РНК. После открепления клеток от поверхности чашек Петри под действием реагента образующуюся суспензию переносили в стерильные пластиковые микропробирки и хранили несколько суток в холодильнике до выделения РНК.

Выделение и очистку суммарной РНК из клеток осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (компания Qiagen, Германия) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой цепи кДНК с помощью набора обратной транскрипции Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (компания Thermo Scientific, США) по рекомендованной производителем прописи. В качестве матрицы на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл применяли 200 нг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для полимеразной цепной реакции (ПЦР) из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР с флуоресцентно мечеными гибридизационными зондами (TaqMan qPCR) проводили с помощью набора qPCRmix-HS (компания «Евроген», Россия) и термоциклера ДТ-322 (компания «ДНК Технология», Россия). В качестве внутреннего стандарта использовали референсный ген GAPDH. Концентрацию его транскриптов измеряли в тех же самых ПЦР смесях, используя гибридизационный зонд, меченый другой флуоресцентной меткой: динамику амплификации кДНК для исследуемых генов измеряли по росту флуоресценции в канале Fam, а динамику амплификации кДНК для референсного гена – в канале Hex. Уровень экспрессии каждого гена измеряли в трех параллельных экспериментах на независимо полученных образцах клеток (биологические параллели). Для каждого образца проводили минимум три параллельные ПЦР в соседних лунках прибора (технические параллели). Полученные данные импортировали в программу Microsoft Exel 2003 и обрабатывали статистически, принимая концентрацию мРНК референсного гена во всех образцах за 1. Конструирование олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для количественной ПЦР осуществляли с помощью онлайн-сервиса IDT PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index), а их синтез – в компании «Синтол» (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Локальное воспаление увеличивает проницаемость капилляров и венул, ускоряя потерю белка и жидкости в межуточное пространство даже при нормальном давлении. Продукция межуточной жидкости (МЖ) может при этом увеличиться в 10–20 раз, что превышает возможности лимфотока и вызывает выраженный отек. Агенты, увеличивающие проницаемость сосудов, и цитокины воспаления индуцируют внутриклеточные сигналы, приводящие к образованию просветов между эндотелиальными клетками, через которые могут проходить макромолекулы и растворы, преодолевая эндотелиальный барьер. В большинстве случаев изменения проницаемости быстро обратимы, хотя при хроническом воспалении они могут сохраняться довольно долго. Агенты, увеличивающие проницаемость эндотелия, действуют разными способами. Например, медиаторы воспаления гистамин, брадикинин и тромбин, индуцирующие быстрое и обратимое увеличение проницаемости, действуют иначе, чем цитокины интерлейкин 1 (IL1) и фактор некроза опухолей (TNF), которые поддерживают повышенную проницаемость в течение нескольких суток. Проницаемость вен, артерий, лимфатических сосудов также контролируется поразному при участии таких внутриклеточных посредников, как цАМФ, Ca2+, фосфо-инозитольные липиды, АФК и различные ГТФазы. Ослабление межклеточных соединений в области адгезионных контактов связывают с фосфорилированием компонентов комплексов кадгерин-катенин, причем чаще фосфорилированию подвергаются тирозиновые остатки в молекуле катенина бета 1, реже – в молекуле плакоглобина.

Гистамин, тромбин, TNF и васкулярный эндотелиальный фактор роста A (VEGFA) усиливают фосфорилирование катенина бета 1, ассоциированного с кадгерином 5, что приводит к увеличению проницаемости монослоев ЭК в культуре. При фосфорилировании цитоплазматического домена самого кадгерина 5 по остатку тирозина Y685 происходит ослабление его связи с катенином дельта 1, что сильно дестабилизирует контакты между эпителиальными клетками. Интересно, что такое фосфорилирование происходит главным образом в эпителиальных клетках вен, где оно индуцируется умеренными гидродинамическими силами. По-видимому, это служит способом избирательного повышения чувствительности сосудов к агентам, увеличивающим их проницаемость. Например, брадикинин уже через 4 минуты после инъекции повышает проницаемость вен, но не артериол. В соответствующих участках образуются небольшие просветы в межклеточных соединениях. Фосфорилированные молекулы представляют собой лишь небольшую субпопуляцию кадгерина 5, именно она является специфической мишенью брадикинина и гистамина. Показано, что при действии брадикинина происходит убиквитинирование фосфорилированных молекул кадгерина 5, их интернализация и деградация. Описанная последовательность событий представляет собой механизм быстрого и обратимого открытия межклеточных соединений в венах при действии таких медиаторов воспаления, как брадикинин и гистамин.

Хемокин CXCL12 (он же stromal cellderived factor 1α/SDF1α) уменьшает проницаемость эндотелия кровеносных сосудов, индуцируемую тромбином. Этот процесс опосредован специфическим рецептором CXCL12 – CXCR4. Ген CXCL12 довольно активно экспрессируется в контрольных эпителиальных клетках. При добавлении MesoEye C71™ уровень его экспрессии возрастает в 1,8 раза, тогда как экспрессия гена CXCR4 не изменяется. В целом, обнаруженный умеренный эффект препарата на активность сигнального пути CXCL12 – CXCR4 должен приводить к некоторой стабилизации эндотелия кровеносных сосудов.

Хотя вход жидкости в лимфатические капилляры происходит под действием гидростатического и осмотического давления, иммунные клетки автономно мигрируют к лимфатическим капиллярам через межуточное пространство, привлекаемые хемокинами, которые секретируются лимфатическими эндотелиальными клетками (ЛЭК). Главную роль в этом процессе играет хемокин CCL21 (CC chemokine ligand 21), его положительно заряженный C-конец имеет высокое сродство ко многим протеогликанам и иммобилизует хемокин на волокнах внеклеточного матрикса (ВКМ), формируя градиент его концентрации. Дендридные клетки, лейкоциты и макрофаги, экспрессирующие CCR7 (CC chemokine receptor 7) – специфический рецептор CCL21 -, детектируют этот градиент и мигрируют в направлении лимфатических сосудов, инициируя воспалительные ответы. Экспрессия гена CCL21 при добавлении MesoEye C71™ снижается в 1,5 раза, что свидетельствует об уменьшении локальных воспалительных реакций.

Проницаемость стенок кровеносных и лимфатических сосудов повышается под действием таких цитокинов воспаления, как интерлейкин 1α (IL1A), TNF и интерферон γ (IFNG), заметно уменьшающих уровень кадгерина 5. Проницаемость эндотелия лимфатических сосудов больше всего (в 2,5 раза) повышается при действии интерферона γ, в то время как интерлейкин 1α и TNF на лимфатические сосуды действуют гораздо слабее, чем на кровеносные. VEGFC также незначительно изменяет проницаемость лимфатических сосудов, а VEGFA вообще не влияет на нее. Возможно, такая низкая чувствительность ЛС является компенсаторным механизмом, предотвращающим фатальное нарушение барьерной функции лимфатического эндотелия в условиях постоянного присутствия высоких концентраций цитокинов и других медиаторов воспаления в лимфатической системе. MesoEye C71™ уменьшает уровень экспрессии генов TNF и IL1A соответственно в 1,5 и 3,8 раза и не влияет на уровень экспрессии гена IFNG. Еще одним медиатором воспалительных ответов является хемокин CXCL1. Кодирующий его ген весьма активно экспрессируется в эндотелиальных клетках микрососудов кожи, но под действием MesoEye C71™ его экспрессия уменьшается в 8 раз. Следовательно, препарат заметно уменьшает выраженность локальных воспалительных реакций.

РИС. 1. Компоненты воспалительной реакции и контролирующие их гены. В нижней части рисунка показаны резидентные и выходящие из кровеносных сосудов иммунные клетки, участвующие в локальных воспалительных ответах. Продукты генов IFNG, TNF, IL1A и CXCL1 повышают проницаемость сосудов и способствуют выходу лейкоцитов из кровеносных сосудов в очаг воспаления, продукт гена CXCL12 стабилизирует стенки сосудов и препятствует выходу лейкоцитов. Продукты генов ICAM1, VCAM1, SELE, CXCL8 и CCL21 обеспечивают проникновение активированных иммунных клеток в лимфатические капилляры и их транспорт к ЛУ. Сигнальные пути VEGFC-VEGFR3, VEGFA-VEGFR2, ANGPT1-TIE2 и IL7-ILTR /IL2RG активируют дренажную функцию лимфатической системы.

Известно, что при локальных воспалительных реакциях происходит быстрый выход нейтрофилов из кровеносных сосудов к очагу воспаления, где они играют роль «первой линии обороны» от повреждений ткани и инфекций. В последние годы было показано, что нагруженные захваченными чужеродными антигенами нейтрофилы не подвергаются апоптозу на месте, а быстро проникают в лимфатическую систему и транспортируются к ближайшим лимфоузлам, где, вероятно, участвуют в формировании адаптивных иммунных ответов. Важную роль в этом процессе играют клеточные рецепторы селектин E (SELE), ICAM1 и VCAM1, а также хемокин CXCL8 (он же IL8). Ген CXCL8 очень активно экспрессируется в эпителиальных клетках микрососудов кожи, но при добавлении MesoEye C71™ 1 уровень его экспрессии уменьшается в 8 раз. Гены SELE, ICAM1 и VCAM1 также довольно активно экспрессируются в эпителиальных клетках. При добавлении MesoEye C71™ экспрессия ICAM1 практически не изменяется, а уровни экспрессии SELE и VCAM1 уменьшаются соответственно в 6,5 и 7 раз. Многие проангиогенные факторы, такие как VEGFA и CXCL8, увеличивают проницаемость сосудов, что связано со стимуляцией фосфорилирования и интернализации кадгерина 5. В обоих случаях фосфорилирование стимулируется малой ГТФазой RAC1. Действие CXCL8 на RAC1 опосредовано специфическим рецептором CXCR2. Как уже отмечалось, экспрессия гена самого CXCL8 под действием MesoEye C71™ многократно уменьшается. Ген CXCR2 в контрольных клетках экспрессируется очень слабо, и добавление MesoEye C71™ практически не влияет на этот процесс. Ген RAC1, напротив, довольно сильно экспрессируется в контрольных клетках и в 1,5 раза слабее в обработанных препаратом. В сумме эти эффекты MesoEye C71™ должны ослаблять негативное влияние провоспалительного хемокина CXCL8 на сосудистую проницаемость.

При экспериментальной хирургической лимфедеме (нарушении оттока лимфы от лимфатических капилляров и периферических лимфатических сосудов) в коже хвоста мышей наблюдается повышение уровня экспрессии 429 генов и уменьшение уровня экспрессии 183 генов. Из этих 429 генов экспрессия примерно 120 генов нормализуется путем добавления VEGFC, что коррелирует с анатомическими признаками нормализации сети лимфатических сосудов. Воздействие экзогенного VEGFC благоприятно сказывается на всех физиологических аспектах воспалительного ответа: уменьшается отек, нормализуется тканевая структура, улучшается дренажная функция лимфатических сосудов, восстанавливается миграция иммунных клеток. Экспрессия гена VEGFC находится на одинаково высоком уровне в контрольных и обработанных MesoEye C71™ клетках. Однако экспрессия гена VEGFR3, кодирующего рецептор VEGFC, под действием препарата возрастает более, чем в 6 раз. Следовательно, в целом активность сигнального пути VEGFC – VEGFR3 заметно увеличивается, а, значит, усиливается и дренажная активность лимфатической системы. Показано, что подавление экспрессии VEGFR3 усиливает формирование воспалительного отека и аккумуляцию клеток воспаления, а также ингибирует лимфангиогенез в воспаленной коже. И, наоборот, активизация лимфангиогенеза с помощью VEGFC супрессирует хронические воспалительные ответы в коже. Следовательно, увеличение активности сигнального пути VEGFC – VEGFR3 под действием MesoEye C71™ способствует более эффективному разрешению хронических воспалительных состояний.

При экспериментальной лимфедеме в коже ушной раковины мышей, вызванной УФВ-облучением, экспрессия ANGPT1 в виде трансгена подавляла внешние признаки отека. У контрольных мышей облучение индуцировало активную инфильтрацию очага отека макрофагами, значительно увеличивало диапедез кровеносных сосудов и проницаемость лимфатических сосудов. Экспрессия ANGPT1 заметно уменьшала все эти эффекты. Средняя толщина лимфатических сосудов у контрольных мышей под действием облучения заметно увеличивалась, у трансгенных мышей этот эффект был менее выражен, а средняя плотность лимфатических капилляров у трансгенных животных, наоборот, была выше, чем у контрольных. Облучение также приводило к потере клаудина 5, а экспрессия ANGPT1 в значительной степени предотвращала ее. Очевидно, увеличенная экспрессия ANGPT1 предохраняет лимфатические сосуды от УФВ-индуцированных повреждений. В культуре лимфатических эндотелиальных клеток она стимулирует миграцию клеток и образование сосудистых структур, а также уменьшает проницаемость клеточного монослоя, индуцируя экспрессию гена клаудина 5 (CLDN5). Оба эффекта опосредованы рецептором TIE2 (он же TEK receptor tyrosine kinase/TEK). Ингибирование экспрессии CLDN5 с помощью комплементарной siRNA, наоборот, увеличивает проницаемость монослоев лимфатических эндотелиальных клеток. У гетерозиготных мышей с мутацией гена клаудина 5 (CLDN5+/-) уровень клаудина в коже заметно снижен, а чувствительность к индукции отека под действием УФВ-облучения резко повышена. При действии умеренной дозы УФВ-облучения, не влияющей на кожу контрольных животных, у таких гетерозиготных мышей развивается выраженный отек, повышается проницаемость лимфатических сосудов и увеличивается их размер. Вероятно, эффекты ANGPT1 связаны именно с индукцией экспрессии CLDN5. В отличие от VEGFC ANGPT1 не влияет на пролиферативную активность ЛЭК: его защитное действие связано главным образом (если не исключительно) с сохранением целостности кровеносных и лимфатических сосудов. Под действием MesoEye™ C71 экспрессия гена CLDN5 возрастает в 1,6 раза, а генов ANGPT1 и TIE2 – в 4 и 1,7 раза, соответственно. Все это свидетельствует о выраженном защитном действии препарата на эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов в условиях, способствующих возникновению локальных воспалительных процессов.

Интерлейкин 7 (IL7) является гомеостатическим цитокином, образующимся в стромальных клетках первичных и вторичных лимфоидных органов, а также в кератиноцитах, гепатоцитах и клетках кишечного эпителия. Важными продуцентами IL7 являются эпителиальные клетки лимфатических узлов. Сигналинг IL7 осуществляется через гетеро димерный рецептор, состоящий из α-цепи рецептора IL7 (IL7Rα/CD127) и общей γ-цепи цитокиновых рецепторов (IL2RG/ CD132). IL7 необходим для развития Tи B-лимфоцитов, поддержания их жизнеспособности и гомеостатической пролиферации. Он играет центральную роль в органогенезе лимфатических узлов. В культуре лимфатических эпителиальных клеток экзогенный IL7 слабо влияет на пролиферацию, но заметно стимулирует адгезию к фибронектину, миграционную активность и транскрипцию гена PROX1. Он также значительно увеличивает способность культивируемых ЛЭК образовывать тубулярные структуры на коллагеновом матриксе. У гомозиготных по нуль-мутации гена IL7Rα (IL7Rα-/-) мышей дренажная активность лимфатических сосудов заметно снижается, а у трансгенных мышей с повышенной экспрессией IL7 она, наоборот, повышена. Дренажная активность ЛС кожи у взрослых мышей дикого типа значительно усиливается при инъекциях рекомбинантного IL7 в течение 7 дней. Это делает IL7 весьма перспективным кандидатом на роль противоотечного препарата. Уровень экспрессии гена IL7 в эпителиальных клетках многократно (в ~17 раз!) возрастает под действием MesoEye C71™. Экспрессия гена IL7Rα практически не изменяется под влиянием препарата, а гена IL2RG умеренно повышается (в 1,8 раза). В целом, полученные результаты указывают на заметное усиление дренажной активности лимфатических сосудов при добавлении MesoEye C71™.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Meso-Eye C71™ препятствует увеличению проницаемости стенок кровеносных сосудов под действием цитокинов воспаления интерлейкина 1α (IL1A) и фактора некроза опухолей (TNF), а также хемокинов воспаления CXCL1, CXCL8 и CCL21, ингибируя экспрессию соответствующих генов и стимулируя экспрессию гена хемокина CXCL12 (stromal cell–derived factor 1α/ SDF1α), стабилизирующего эндотелий кровеносных сосудов. MesoEye C71™ способствует более эффективному и быстрому разрешению хронических воспалительных состояний, стимулируя активность сигнальных путей VEGFC – VEGFR3, ANGPT1 – TIE2 и IL7 – IL7Rα – IL2RG, улучшающих дренажную функцию лимфатических сосудов и препятствующих увеличению сосудистой проницаемости, диапедезу и возникновению локальных воспалительных отеков.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Cromer W.E., Zawieja S.D., Tharakan B. et al. The effects of inflammatory cytokines on lymphatic endothelial barrier function. Angiogenesis. 2013, 17, pp. 395–406.

2. Choi I., Lee S., Hong Y.-K. The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012, 2, a006445.

3. Freitag F.M., Cestari T.F. What causes dark circles under the eyes? J Cosmet Dermatol. 2007, 6, pp. 211–215.

4. Gavard J., Hou X., Qu Y. et al. A role for a CXCR2/ phosphatidylinositol 3-kinase gamma signaling axis in acute and chronic vascular permeability. Mol Cell Biol. 2009, 29, pp. 2469–2480.

5. Iolyeva M., Aebischer D., Proulx S.T. et al. Interleukin-7 is produced by afferent lymphatic vessels and supports lymphatic drainage. Blood. 2013, 122, pp. 2271–2281.

6. Jin da P., An A., Liu J. et al. Therapeutic responses to exogenous VEGF-C administration in experimental lymphedema: immunohistochemical and molecular characterization. Lymphat Res Biol. 2009, 7, pp. 47–57.

7. Kajiya K., Kidoya H., Sawane M. et al. Promotion of lymphatic integrity by angiopoietin-1/Tie2 signaling during inflammation. Am J. Pathol. 2012, 180, pp. 1273–1282.

8. Kobayashi K., Sato K., Kida T. et al. Stromal cell–derived factor-1α/C-X-C chemokine receptor type 4 axis promotes endothelial cell barrier integrity via phosphoinositide 3-kinase and Rac1 activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014, 34, pp. 1716–1722.

9. Matsumoto-Okazaki Y., Yamane J., Kajiya K. Realtime imaging of interaction between macrophages and lymphatic vessels in an in vitro model to study inflammatory resolution. J. Dermatol. Sci. 2015, 77, pp. 76–79.

10. Matsumoto-Okazaki Y., Furuse M., Kajiya K. Claudin-5 haploinsufficiency exacerbates UVBinduced oedema formation by inducing lymphatic vessel leakage. Exp. Dermatol. 2012, 21, pp. 557–559.

11. Medzhitov R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 2008, 454, pp. 428–435.

12. Orsenigo F., Giampietro C., Ferrari A. et al. Phosphorylation of VE-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Commun. 2012.

13. Rigby D.A., Ferguson D.J., Johnson L.A., Jackson D.G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. J. Leukoc. Biol. 2015, 98, pp. 897–912.

14. Sobel R.K., Carter K.D., Allen R.C. Periorbital edema: a puzzle no more? Curr Opin Ophthalmol. 2012, 23, pp. 405–414.

Подпишитесь на наши
обновления