Препарат Meso-Xanthin F199™ и его роль в эпигенетическом механизме коррекции возрастных изменений кожи.

Исследования опубликованные в журнале  Эстетичекска медицина №4/2013 /.,часть 1

 

Авторы:

Б.ФВанюшин  доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

В.В. Ашапкин — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Л.И. Кутуева — научный сотрудник, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Э. Тестер — M.S. PhD, ABG LAB LLC, USA.

 

Реферат

Эффективное терапевтическое действие препарата мезоксантин (Meso-Xanthin F199) связано с его влиянием на эпигенетические механизмы и системы клеток кожи. Под действием мезоксантина в культуре фибробластов кожи человека многократно увеличивается экспрессия генов важных белков кожи − интегринов и GADD45A. Интегрины играют ключевую роль в двусторонних взаимодействиях клеток и межклеточного матрикса кожи, а белок GADD45A участвует в репарации поврежденной ДНК и ее деметилировании. Эпигенетическое терапевтическое действие мезоксантина, по-видимому, связано с модуляцией им энзиматических модификаций ДНК и активности регуляторных элементов генома, стимулирующих экспрессию генов интегринов и GADD45A в фибробластах кожи человека.

 

1. ВВЕДЕНИЕ

Ухудшение состояния кожи − один из наиболее очевидных внешних признаков старения. Попытки создания научно обоснованных способов замедления старения и даже «омолаживания» кожи стимулировали множество исследований, благодаря которым клеточные механизмы старения кожи в значительной мере прояснились [1−4].

 

2. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ КОЖИ

Хронологическое старение кожипостепенно прогрессирующий процесс, связанный с уменьшением количества клеток и ослаблением ихфункциональной активности. В числе последствий этого процесса – все менее эффективное обновление кожного матрикса: равновесие между деструктивными и синтетическими процессами все больше сдвигается в сторону первых. В результате происходит прогрессивное уменьшение содержимого матрикса. Активное, индуцированное действием ультрафиолета и других агрессивных внешних факторов старение – более быстрый деструктивный процесс, приводящий к частичному разрушению компонентов межклеточного матрикса и неполноценному их ресинтезу. Результат этих внутренне разных процессов внешне сходен: утрата эластичности кожи, ее способности восстанавливать исходную форму и т.п.

При хронологическом старении эпидермис истончается, замедляется его обновление. Коррелятами этих изменений на молекулярном уровне служат постепенное уменьшение экспрессии генов, кодирующих белки, функции которых тесно связаны с дифференцировкой и пролиферацией кератиноцитов. У молодых людей во всех слоях эпидермиса в большом количестве присутствуют кератин 10, инволюкрин, преальбумин, белок теплового шока 27 и белок Rho B. При старении содержание этих белков в эпидермисе постепенно уменьшается, и у очень старых индивидов они могут вообще не обнаруживаться.

Фотостарение, наоборот, обычно приводит к утолщению эпидермиса. Оно нарушает нормальную дифференцировку кератиноцитов и синтез промежуточных филаментов, что, вкупе с обезвоживанием из-за дефицита гиалуроновой кислоты, приводит к замедлению отшелушивания мертвых кератиноцитов и образованию толстого, твердого, хрупкого эпидермиса. Базальная мембрана, соединяющая эпидермис с дермой, с возрастом истончается. В результате активации металлопротеиназ уменьшается количество коллагенов IV и VII типов, что ослабляет связь эпидермиса с дермой.

При ультрафиолетовом облучении происходит активация синтеза металлопротеиназ 1, 2, 3 и 9 и подавляется синтез коллагена I типа. В результате резко увеличивается скорость деградации коллагеновых фибрилл. Эластические свойства кожи в значительной степени определяются фибриллами, состоящими из эластина, фибриллина и эластин-связывающего белка. При хронологическом старении они постепенно укорачиваются и исчезают. Под влиянием УФ-облучения происходит частичная деградация эластичных фибрилл, обусловленная действием эластазы, секретируемой фибробластами. Ситуация усугубляется синтезом новых аномальных фибрилл, в результате чего в верхнем и среднем слоях кожи накапливается плотный аморфный материал (актиническое повреждение). В комплексе все описанные процессы резко нарушают эластические свойства кожи.

Влагоудерживающие свойства кожи определяются главным образом глюкозаминогликанами, присутствующими в свободной форме (гиалуроновая кислота, ГК) или в комплексах с белками (протеогликаны). С возрастом их количество уменьшается. К тому же ГК и протеогликаны (версикан, декорин) укорачиваются и подвергаются модификациям, уменьшающим их способность удерживать воду.

Наиболее выражены в дерме структурные изменения. В дерме молодой кожи коллагены I и III типов образуют упорядоченные фибриллы, которые контактируют с цитоскелетом фибробластов. В стареющей коже (имеем в виду хронологическое старение) содержание коллагенов уменьшается, коллагеновая сеть постепенно исчезает, а фибробласты приобретают более округлую форму и беспорядочную ориентацию. Коллагеновые фибриллы подвергаются неэнзиматическим сшивкам, в результате чего образуются аномальные недеградирующие структуры. В отличие от нормальных коллагеновых фибрилл, такие аномально сшитые формы не разрушаются металлопротеиназами и желатиназами и не могут встраиваться во вновь образующиеся коллагеновые фибриллы. Трехмерная структура межклеточного матрикса нарушается с возрастом все в большей степени.

Следует подчеркнуть, что описанные процессы являются следствием нарушения структурно-функциональных взаимодействий между фибробластами и межклеточным матриксом. В ходе развития фибробласты эпигенетически «программируются» на основную задачу – производство коллагенового матрикса. На поверхности фибробластов имеются специальные мембранные белковые рецепторы – интегрины, основным назначением которых является двусторонняя передача сигналов от межклеточного матрикса в цитоплазму фибробластов и наоборот. При связывании коллагенов и других элементов межклеточного матрикса с интегринами последние собираются в тесные группы, образующие комплексы с актиновым цитоскелетом с внутренней стороны клеточной мембраны.

Образующиеся в результате локальные комплексы адгезии не только играют структурную роль, но и имеют важнейшее функциональное значение. Со стороны цитоплазмы они запускают сигнальные каскады, регулирующие метаболизм фибробластов, в том числе, определяющие баланс между синтезом коллагенов и их обновлением под действием металлопротеиназ и других гидролитических ферментов. Кроме того, адгезивные комплексы позволяют фибробластам принимать вытянутую «распластанную» форму, необходимую для их функциональной активности, выживания и нормального роста. Со стороны межклеточного матрикса интегрины обеспечивают передачу механического напряжения с цитоскелета на коллагеновые фибриллы. В молодой коже упорядоченные коллагеновые фибриллы оказывают сопротивление этим механическим напряжениям.

Итак, фибробласты и волокна матрикса находятся в состоянии постоянного механического напряжения, играющего огромную роль в функциональной активности фибробластов. При увеличении механического напряжения, например в ходе развития и роста органов, происходит активация синтеза коллагенов и других компонентов межклеточного матрикса. Тем самым обеспечивается скоординированный рост самих фибробластов и окружающего их матрикса. При уменьшении напряжения, наоборот, происходят уменьшение синтеза коллагенов и активация синтеза разрушающих их металлопротеиназ. Фрагментация коллагенов металлопротеиназами нарушает их связывание с интегринами и разрушает локальные адгезивные комплексы. В результате механическое напряжение фибробластов уменьшается еще сильнее, они принимают округлую форму, производят все меньше коллагенов и все больше металлопротеиназ. Однажды возникнув в ходе естественного старения или под действием агрессивных факторов внешней среды, дисбаланс между процессами синтеза и разрушения коллагеновых фибрилл становится самоусиливающимся. Это в конечном итоге приводит к образованию истонченной, хрупкой, бедной коллагеновыми фибриллами кожи, характерной для старых людей.

Содержание коллагенов в коже старых (80 лет и более) индивидов примерно в 3−4 раза меньше, чем в коже молодых (18−29 лет) [5]. Однако при переносе из кожи в клеточную культуру фибробласты старых людей уступают фибробластам молодых по способности к синтезу коллагенов всего лишь в полтора раза. Возможно, одной из причин расхождения между этими величинами является большая пролиферативная активность фибробластов молодой кожи. С возрастом уменьшается способность не только к репликации ДНК, но и к репарации ее повреждений. Очевидно, уменьшение синтетической активности фибробластов кожи при старении обусловлено как внутренними эпигенетическими изменениями внутри клеток, так и нарушением их взаимодействия с межклеточным матриксом. Вполне вероятно, что эти два процесса взаимосвязаны.

 

3. ВОЗМОЖНОСТИ ЭСТЕТИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ В ЗАМЕДЛЕНИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ СТАРЕНИЯ КОЖИ

При инъекциях в кожу гиалуроновой кислоты происходит механическое растяжение межклеточного матрикса, которое, очевидно, должно стимулировать синтез коллагена и подавлять синтез разрушающих его металлопротеиназ [6]. Действительно, через 4 и 13 недель после инъекций гиалуроновой кислоты в соответствующих участках кожи наблюдается многократное повышение уровней транскрипции генов коллагенов I и III типов, а также усиление экспрессии генов, кодирующих фактор роста соединительной ткани (CTGF) и все изоформы трансформирующего фактора роста бета (TGF-β). Известно, что эти факторы способствуют накоплению в коже коллагенов. По-видимому, в результате инъекций происходит растяжение эндогенных коллагеновых фибрилл, связанных с фибробластами посредством интегринов. Это растяжение приводит к активации путей передачи сигналов в цитоплазму и далее в ядро фибробластов и как следствие − к активации экспрессии определенных генов.

Стимуляция любого звена сигнального пути, осуществляющего двустороннее регуляторное взаимодействие между фибробластами и межклеточным матриксом, должна приводить к улучшению состояния стареющей кожи. Наиболее устойчивым это улучшение будет в случае непосредственного воздействия на эпигенетические механизмы, с которыми связано стабильное ослабление синтетической активности фибробластов при старении.

Можно ли замедлить процесс старения кожи или даже частично обратить его вспять? Одним из довольно очевидных способов является избегание внешних факторов, резко ускоряющих ее старение, в первую очередь, избыточного ультрафиолетового облучения. Но как быть с неизбежным естественным старением?

Одним из главных эпигенетических механизмов, стабильно изменяющих экспрессию генов при старении, является процесс энзиматического метилирования ДНК. Большинство генов человека и животных содержат характерные регуляторные участки ДНК, обогащенные потенциальными мишенями метилирования – CG-динуклеотидами. В активных генах эти участки (CG-островки) неметилированы, а их метилирование приводит к подавлению активности генов. Широкомасштабное исследование генома у людей разного возраста показало, что при старении происходит метилирование и инактивация определенных генов в клетках кожи. Очевидно, оптимальным способом борьбы со старением клеток было бы избирательное воздействие на эти гены, способствующее их возвращению в исходное, неметилированное, активное состояние.

Препарат Meso-Xanthin F199 компании ABG LAB LLC (США) позиционируется как новейший препарат для комплексной терапии возрастных изменений кожи. Он разработан профессором по акушерству и гинекологии Медицинской школы Университета Нью-Йорка Борисом Петриковским. Это – многокомпонентный препарат довольно сложного состава: помимо основных компонентов, каротиноида фукоксантина и гиалуроновой кислоты, он содержит комплекс аминокислот, антиоксидант тиоредоксин, витамины A, C и E, медьсодержащий трипептид и три фактора роста (эпидермальный, инсулиноподобный и основной фактор роста фибробластов). По информации разработчиков мезоксантин на эпигенетическом уровне инициирует процессы репарации ДНК, в особенности в условиях окислительного стресса и при старении, а также стимулирует пролиферацию и дифференцировку прогениторных клеток кожи. Предполагается, что за эпигенетические эффекты мезоксантина в первую очередь ответственен фукоксантин. Этот пигмент, получаемый из коричневых водорослей, довольно широко известен как средство борьбы с ожирением, метаболическими, сердечно-сосудистыми и онкологическими  заболеваниями. В экспериментах на животных показано также, что он обладает способностью защищать кожу от фотоповреждения. Все это побудило нас провести независимое исследование клинической эффективности мезоксантина, а также эпигенетических эффектов мезоксантина и его основного компонента фукоксантина.

Поскольку центральным звеном в сигнальном пути, связывающем фибробласты и межклеточный матрикс, являются мембранные белковые рецепторы интегрины, мы исследовали активность и степень метилирования их генов в культуре первичных фибробластов кожи человека при воздействии на них данного препарата.

 

Показаниями к применению препарата Mesо-Xanthin F199 являются:

– профилактика увядания кожи;

– возрастные изменения кожи (морщины, потеря тонуса и эластичности, гравитационный птоз I–II степени;

– подготовка к пластической операции и реабилитация кожи в послеоперационном периоде;

– восстановление кожи после срединных и глубоких пилингов, лазерного лечения, ожогов  различного генеза;

– гиперпигментация;

– дегидратация кожи;

– купероз.

 

Противопоказаниями к проведению процедур являются:

– острые воспалительные высыпания (акне, герпес), обострение хронических кожных заболеваний в зоне инъекций;

– повышенная чувствительность к одному из компонентов препарата;

– наличие в анамнезе аутоиммунных заболеваний или проведение иммуносупрессивной терапии;

– тяжелые соматические заболевания в стадии обострения;

– прием антикоагулянтов, ретиноидов;

– наличие постоянных имплантатов в зоне предполагаемой коррекции;

– беременность и лактация;

– возраст моложе 35 лет.

 

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичные фибробласты кожи человека выращивали в монослойных культурах в течение 12 генераций, после чего добавляли к ним различные количества мезоксантина или фукоксантина и продолжали выращивание в течение еще 2 генераций. Мезоксантин представляет собой густую вязкую жидкость, содержащую множество компонентов в разных молярных концентрациях, поэтому его дозу выражали как количество микролитров в расчете на 1 мл культуральной среды. Оптимальную эффективную дозу мезоксантина подбирали эмпирически. Фукоксантин является чистым веществом, оптимальные концентрации которого на уровне клеточных культур известны из литературы. Фотографии клеток представлены на рисунке 1.

111

Рис. 1. Культура фибробластов кожи человека. Оранжевые пятна клеточныеядра (окраска DAPI); зеленые «волокна» цитоскелет (окраскафлуоресцентно мечеными антителами к бетатубулину). Ув. 1000 Х

По окончании выращивания клеток культуральную среду осторожно удаляли и к клеткам добавляли 2 мл раствора RNA Cell Protect Reagent (Qiagen, Германия) и инкубировали их в течение 10 мин при плавном покачивании. При этом происходило открепление клеток от поверхности чашек Петри и одновременная консервация их РНК. Суспензию клеток переносили в микропробирки типа Эппендорф и выделяли из них РНК с помощью набора RNeasy Mini Kit по прописи, рекомендуемой производителем (Qiagen, Германия).

Полученные образцы РНК выравнивали по концентрации и синтезировали на них первую нить кДНК с помощью набора для обратной транскрипции Omniscript RT Kit (Qiagen, Германия). Количественное определение транскриптов изучаемых генов проводили с помощью TaqMan ПЦР. Конструирование олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых гибридизационных зондов выполняли с помощью интернет-сервиса PrimerQuest.

Результаты ПЦР-анализа нормализовали по концентрации мРНК белка «домашнего хозяйства» глицеральдегид-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). Гибридизационные зонды для детекции мРНК исследуемых генов и GAPDH метили разными флуоресцентными метками, что позволяло проводить реакции ПЦР для каждой пары «исследуемый ген − GAPDH» в одной пробирке. Первичный анализ результатов осуществлялся в автоматическом режиме программой, управляющей прибором для проведения ПЦР с детекцией в реальном времени ДТТ-32 («ДНК-Технология», Россия). Уровень экспрессии каждого гена измеряли в трех независимых экспериментах на фибробластах, полученных от разных доноров (биологические параллели). Для каждого из этих экспериментов проводили минимум три параллельных независимых измерения (технические параллели). Среднее арифметическое значение (m) уровня экспрессии каждого гена и величину стандартного отклонения (σ) вычисляли в программе Microsoft Exel. Изменение уровня экспрессии считалось статистически значимым (p<0,05), если оно превышало величину стандартного отклонения в 2 или более раза.

Характер метилирования генов исследовали с помощью метода бисульфитной модификации с последующей ПЦР-амплификацией и секвенированием по Сэнгеру. В настоящее время этот метод является «золотым стандартом» в исследованиях метилирования генов.

ДНК фибробластов выделяли с помощью набора DNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). Обработку бисульфитом натрия осуществляли с помощью набора EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Германия). Олигонуклеотидные праймеры для амплификации модифицированной бисульфитом ДНК, сконструированные с помощью интернет-сервиса BiSearch, были синтезированы и предоставлены нам фирмой «Синтол» (Россия).

Дискретные продукты амплификации очищали препаративным электрофорезом в гелях агарозы, экстрагировали с помощью набора GenElute Gel-Extraction Kit (Sigma-Aldrich, США) и секвенировали с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (ЦКП «Геном», Россия).

Клиническую эффективность препарата Mesо-Xanthin F199 в коррекции инволюционных изменений кожи оценивали по его влиянию на следующие возрастные изменения кожи:

– снижение тургора;

– морщины, дряблость, потеря эластичности;

– деформация овала лица;

– тусклый цвет кожи;

– дисхромия

Под нашим наблюдением находились 30 женщин в возрасте от 35 до 65 лет.

С учетом возраста пациенток они были разделены на 3 группы:

1 группа – от 35 до 45 лет (10 человек);

2 группа – от 45 до 55 лет (10 человек);

3 группа – от 55 до 65 лет (10 человек).

Всем пациенткам проводили лечение по следующей схеме: препарат вводили интрадермально в технике микропапул в следующие зоны:, в латеральные поверхности щек и подчелюстной области, лоб и периорбитальные области. Количество препарата, вводимого за одну процедуру, составляло 0,7 мл. Всем пациенткам был проведен курс лечения, состоящий из 4 сеансов с интервалом 10 дней.

Для объективизации результатов клинических наблюдений всем пациенткам в динамике проводилась ультразвуковая структурно-функциональная диагностика кожи.

 

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эпигенетические исследования

При обработке бисульфитом натрия происходит превращение неметилированных остатков цитозина в остатки урацила, а метилированные цитозины не изменяются. После ПЦР-амплификации обработанной таким образом ДНК и ее последующем секвенировании (расшифровке последовательности нуклеотидов) все сохранившиеся цитозиновые остатки соответствуют метилированным позициям в исходной ДНК.

На рисунках 2 и 3 представлены результаты анализа уровня экспрессии гена интегрина бета 4 (ITGB4) в контрольных культурах фибробластов и при их культивировании с препаратами Meso-Xanthin F199 и фукоксантин в разной концентрации.

112

Рис. 2. Экспрессия гена ITGB4 в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных в присутствии различных количеств препарата MesoXanthinF199. Количество добавленного мезоксантина (мкл на 1 мл культуральнойсреды) показано по горизонтальной осиуровень экспрессии гена ITGB4 вусловных единицах относительно уровня экспрессии базового гена GAPDH, принятого за 1, показан по вертикальной оси. Высота столбиков соответствуетсреднему арифметическому результатов параллельных экспериментов, вертикальные черточкистандартным отклонениям.

113

Рис. 3. Экспрессия гена ITGB4 в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных при различной концентрации фукоксантина. По горизонтали конечная концентрация фукоксантина в культуральной среде (мкМ), повертикалиуровень экспрессии гена ITGB4 в условных единицахотносительно уровня экспрессии базового гена GAPDH, принятого за 1.

Как можно видеть на диаграммах, добавление в культуру фибробластов и мезоксантина, и его главного компонента фукоксантина приводит к статистически значимому повышению уровня транскрипции гена ITGB4. Благодаря тому, что фукоксантин является индивидуальным точно дозируемым веществом (в отличие от сложной многокомпонентной смеси, которую представляет собой мезоксантин), для него нам удалось более четко проследить динамику этого процесса при увеличении дозы препарата: в диапазоне концентраций от 2 до 20 мкМ наблюдается прямая корреляция с экспрессией гена, при дальнейшем повышении концентрации фукоксантина (при 40 мкМ) экспрессия гена несколько уменьшается.

На рисунках 4 и 5 представлены данные аналогичных экспериментов по экспрессии гена интегрина альфа 6, являющегося партнером гена интегрина бета 4 при образовании функционально активных гетеродимеров рецептора в клетках кожи.

114

Рис. 4. Экспрессия гена ITGA6 в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных в присутствии различных количеств препарата MesoXanthinF199. Детали см. подписи к рисунку 2.
115

Рис. 5. Экспрессия гена ITGA6 в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных при различной концентрации фукоксантина. Детали см. подписи к рисунку 3.

Можно видеть, что под воздействием мезоксантина и фукоксантина происходит ярко выраженная и зависимая от дозы стимуляция экспрессии гена интегрина альфа 6. При оптимальных концентрациях (10 мкл на 1 мл культуральной среды мезоксантина и 20 мкМ фукоксантина) экспрессия гена интегрина альфа 6 увеличивается в 10−17 раз!

В контрольных культурах фибробластов ген интегрина альфа 6 экспрессировался заметно слабее, чем ген интегрина бета 4. Учитывая, что молекула функционально активного рецептора представляет собой гетеродимер из этих двух интегринов, можно заключить, что интегрин альфа 6 в «естественных» условиях является лимитирующим компонентом, определяющим количество рецептора, а большая часть интегрина бета 4 избыточна. В фибробластах, культивированных в присутствии оптимальных доз мезоксантина или фукоксантина, уровни экспрессии генов в значительной степени выравниваются, то есть большая часть молекул обоих интегринов может войти в состав функционально активных димеров рецептора.

Известно, что интегрин альфа 6 являются своеобразным мастер-регулятором транскрипции и трансляции остальных интегринов, присутствующих в клетках кожи [13]. Как видно из диаграмм (см. рис. 2 и 3), уровень экспрессии гена интегрина бета 4 является стабильно высоким и изменяется в относительно небольших пределах. Это проявляется не только в том, что он несколько повышается лишь при действии довольно высоких доз мезоксантина  и фукоксантина, но и в том, что при действии повышенной концентрации фукоксантина (40 мкМ) он уменьшается совсем немного.

Иначе ведет себя ген интегрина альфа 6. Уровень его экспрессии в контрольной культуре фибробластов в 3−4 раза ниже, чем у гена интегрина бета 4, но он ощутимо повышается даже под действием минимальных доз мезоксантина и фукоксантина. В целом активность этого гена гораздо более лабильна. Так, под действием повышенной концентрации фукоксантина уровень экспрессии гена интегрина альфа 6 резко падает. Создается впечатление, что в фибробластах кожи именно этот ген служит основной мишенью в процессах регуляции экспрессии генома под действием внешних факторов, а модуляция активности остальных генов интегринов вторична.

Ген интегрина альфа 6 в качестве потенциальной мишени метилирования содержит CG-островок, начинающийся с 426 нуклеотида выше точки инициации транскрипции и заканчивающийся на 1343 нуклеотиде ниже нее. Чтобы выяснить, не связана ли активация гена при действии мезоксантина и фукоксантина с деметилированием этого островка, мы проанализировали характер его метилирования в контрольной культуре фибробластов и в клетках, культивированных в присутствии мезоксантина (10 мкл на 1мл культуральной среды). Оказалось, что в обоих случаях CG-островок не метилирован (рис. 6). Проверять действие фукоксантина на метилирование этого гена в такой ситуации не имело смысла.

116

Рис. 6. 5концевой CpGостровок гена интегрина альфа 6 не метилирован. Верхняя часть рисунка схема гена ITGA6 в геномном браузере UCSC (University of California, Santa Cruz). Синие прямоугольники экзоны, горизонтальные линии между ними интроны. Прямоугольники зеленогоцвета CG-островки. Цифры абсолютные координаты гена во 2-йхромосоме. В средней части рисунка схема 5′-концевого участка гена вбольшем масштабе. Нижняя часть рисунка схема метилирования 5′-концевого CG-островка, автоматически сгенерированная онлайнсервисом MethTools 2.0 по результатам бисульфитного секвенирования. Не метилированные CG-динуклеотиды изображаются в виде незакрашенныхкружочков, метилированные в виде черных

Очевидно, что ген находится в активном состоянии даже в контрольных клетках, и его дополнительная активация под действием препарата не является следствием деметилирования. Вполне вероятно, что «оперативная» регуляция активности гена интегрина альфа 6 достигается с помощью более лабильных эпигенетических механизмов, например изменения характера модификации гистонов.

Аналогичную картину мы обнаружили и для гена интегрина бета 4 (рис. 7). Как и его партнер, он содержит 5’-концевой CG-островок (на участке от -621 до +304 нуклеотида относительно точки инициации транскрипции), практически не метилированный в контрольных и обработанных препаратом фибробластах.

117

Рис. 7. 5концевой CpGостровок гена интегрина бета 4 не метилирован. Верхняя часть рисунка схема гена ITGB4 в геномном браузере UCSC (University of California, Santa Cruz). Синие прямоугольники экзоны, горизонтальные линии между ними интроны. Прямоугольники зеленогоцвета CG-островки. Цифры абсолютные координаты гена в 17-йхромосоме. В средней части рисунка схема 5′-концевого участка гена вбольшем масштабе. Нижняя часть рисунка схема метилирования 5′-концевого CG-островка, автоматически сгенерированная онлайнсервисом MethTools 2.0 по результатам бисульфитного секвенирования. Неметилированные CG-динуклеотиды изображаются в виде незакрашенныхкружочков, метилированные в виде черных

Нельзя исключать, что активация экспрессии генов интегринов является не прямым следствием действия использованных в наших экспериментах препаратов, а вторичным эффектом активации каких-то других регуляторных генов. Поскольку их природа нам пока неизвестна, мы попытались обнаружить косвенные признаки такой активации, исследовав экспрессию ряда генов, кодирующих существенные для метилирования ДНК ферменты.

Оказалось, что экспрессия генов всех трех отвечающих за метилирование ДНК ферментов (ДНК-метилтрансфераз DNMT1, DNMT3a и DNMT3b) под действием исследуемых препаратов практически не изменяется (данные не приведены). Это свидетельствует о том, что при действии мезоксантина и фукоксантина глобального изменения в процессах метилирования ДНК в клетках не происходит.

С другой стороны, при исследовании транскрипции гена мультифункционального белка GADD45A, участвующего в реакциях клетки на воздействия, повреждающие ДНК, мы обнаружили любопытный факт. Оказалось, что под воздействием мезоксантина и фукоксантина происходит заметная активация экспрессии этого гена, величина которой  находится в прямой зависимости от дозы препаратов (рис. 8 и 9).

118

Рис.8. Экспрессия гена GADD45A в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных в присутствии различных количеств препарата MesoXanthinF199. Детали см. подписи к рисунку 2.

125

Рис. 9. Экспрессия гена GADD45A в культуре фибробластов кожи человека, инкубированных при разной концентрации фукоксантина. Детали см. подписи к рисунку 3.

Известно, что белок GADD45A участвует в активном избирательном деметилировании локусов ДНК [14, 15]. Механизмы этого деметилирования тесно связаны с другими функциями GADD45A. Показано, что он избирательно связывается с участками ДНК, являющимися мишенями активного деметилирования, образуя при этом комплексы с белками, осуществляющими эксцизионную репарацию ДНК. По всей видимости, GADD45A каким-то образом «узнает» метилированные участки ДНК и рекрутирует к ним белки эксцизионной репарации. Последние, в свою очередь, вырезают метилированные остатки цитозина и встраивают на их место неметилированные. К сожалению, до сих пор не выяснено, что направляет белок GADD45A к определенным участкам ДНК. Возможно, «помощниками» в этом процессе служат белки, участвующие в регуляции экспрессии генов на уровне хроматина, такие, как гистоны, ядерные рецепторы гормонов и другие.

Влиянием на экспрессию генов посредством их активного деметилирования можно объяснить множественные фенотипические эффекты, возникающие под действием этого белка.. Например, известно, что активность GADD45A предохраняет генетический аппарат клеток от повреждений и тем самым препятствует возникновению опухолей.

Клинические исследования

Степень выраженности возрастных изменений кожи оценивалась по 5-балльной шкале WSRS (Wrinkle Severity Rating Scale), которая учитывает характер, количество и глубину морщин:

5 баллов – максимальные возрастные изменения: глубокие протяженные складки на коже, при растяжении кожи пальцами  остаются зоны депрессии глубиной 4–5 мм;

4 балла – выраженные изменения: глубокие длинные складки с остаточной глубиной при растяжении пальцами около 2 мм;

3 балла – появление статических морщин и складок, при натяжении кожа полностью расправляется;

2 балла – незначительные возрастные изменения:

тонкие поверхностные морщины;

1 балл – отсутствие морщин.

Клинические проявления гравитационного птоза оценивались следующим образом:

1 степень – небольшой избыток кожи в области век, слегка «оплывший» контур лица, жировой комок Биша расположен в нормальных границах, носогубные складки умеренно выражены;

2 степень – нависание верхних век, жировые грыжи нижних век, легкий птоз жирового комка Биша, намечающийся второй  подбородок, носогубные складки выражены сильнее;

3 степень – значительный избыток кожи верхних век, жировые грыжи нижних век,

выраженный птоз мышечно-апоневротической системы в области лица, включая платизму, что приводит к появлению «брылей», провисанию кожи в подбородочно-шейной зоне, еще большему углублению носогубных складок.

Динамика изменений степени выраженности морщин и гравитационного птоза в ходе исследования представлена в таблицах  1 и 2.

 

Табл. 1. СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ МОРЩИН ПРИ ПРИМЕНЕНПИИПРЕПАРАТА MESO-XANTHIN F199

  Выраженность морщин по шкале WSRS примечание

Количествопациентов

1 балл 2 балла 3 балла 4 балла

5 баллов

 

1 группа

  6 4     Допроцедур
7 3      

После 4 процедур

 

2 группа

  4 4 2   Допроцедур
  7 2 1  

После 4 процедур

 

3 группа

    6 4  

Допроцедур

    8 2  

После 4 процедур

 

 

Табл. 2. ДИНАМИКА ПРОЯВЛЕНИЙ ГРАВИТАЦИОННОГО ПТОЗА ВРЕЗУЛЬТАТЕ ПРМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА MESO-XANTHIN F199

                                  Выраженность гравитационногоптоза

 

примечание

Количествопациентов

1 степень 2 степень

степень

 

1 группа

7 3   Допроцедур
9 1  

После 4 процедур

2 группа

4 6   Допроцедур
7 3  

После 4 процедур

 

3 группа

1

6

3

Допроцедур
3 5 2

После 4 процедур

 

 

Полученные клинические данные убедительно демонстрируют положительную динамику состояния кожи после проведенного курса лечения препаратом Mesо-Xanthin F199 – уменьшение степени выраженности морщин и гравитационного птоза. Максимально выраженный эффект был отмечен в плане уменьшения морщинистости кожи. Влияние проведенного курса лечения на гравитационный птоз выражено в меньшей степени, что было вполне ожидаемо, так как основной зоной воздействия препарата Mesо-Xanthin F199 является дермальный слой, а в формировании птоза участвуют все структуры мягких тканей лица – подкожно-жировая клетчатка, мышцы, связочный аппарат и др.

    Лабораторные исследования

Как уже было сказано, для объективизации результатов клинических наблюдений всем пациенткам проводилась  ультразвуковая структурно-функциональная диагностика кожи  по каждой возрастной группе до и после применения Mesо-Xanthin F199. Измерения осуществлялись на аппарате Dermascan C, Cortex Technology (Hadsund, Дания).

Измеряли толщину эпидермиса, толщину дермы, гладкость пограничных линий эпидермис/дерма/гиподерма, а также эхогенность верхних и нижних слоев дермы. Все эти параметры прослеживали в следующих зонах лица: латеральных отделах периорбитальной области ( в зоне «гусиных лапок»), на скулах, в углах рта, на подбородке.

Результаты УЗ-сканирования представлены в таблице 3 и на рисунках 10–15.

 

ТАБЛ. 3. ИЗМЕНЕНИЕ ЭХОГЕННОСТИ КОЖИ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТА MESО-XANTHIN F199

 

Возраст

Зона

ЭхогенностьА1,

(отн.единицы)

«До» 

ЭхогенностьА2,

(отн.единицы)

«После» 

А2/А1  

65 лет

Угол глаза

Угол рта                     

Областьскулы

Областьподбородка

33,59±0,01

24,96±0,01

35,03±0,01

29,55±0,01

56,45±0,01

53,31±0,01     

43,06±0,01

37,22±0,01

1,68

2,1

1,23

1,25

53 года

Угол глаза

Угол рта   

Областьскулы

Областьподбородка

42,20±0,01

40,26±0,01

33,20±0,01

21,40±0,01

62,43±0,01

59,04±0,01

56,40±0,01

38,23±0,01

1,47

1,46

1,69

1,78

51 год

Угол глаза

Угол рта

Областьскулы

Областьподбородка

32,60±0,01

30,60±0,01

30,88±0,01

18,11±0,01

74,16±0,01

62,47±0,01

50,24±0,01

39,56±0,01

2,27

2,04

1,62

2,18

45 лет Угол глаза

Угол рта

Областьскулы

Областьподбородка

42,84±0,01

44,80±0,01

40,27±0,01

18,14±0,01

71,39±0,01

62,98±0,01

65,46±0,01

38,66±0,01

1,66

1,40

1,62

2,10

1-1

2-1

Рис.10.  Сканограммы кожи в области угла рта пациентки 39 лет: до (а) и после 4-х  процедур(б)

3-2

Рис.11.   Сканограммы кожи в области правой скулы пациентки 41 года: до (а) и после 4 процедур

12-1

Рис.12. Сканограммы кожи  в области подбородка пациентки 55 лет:  до (а), после 2 (б)

и 4 (в) процедур

4-1

Рис.13.   Сканограммы кожи в области подбородка пациентки 68 лет: до (а) и после 4 процедур

 

Приведенные клинические данные и результаты УЗ-сканирования кожи наглядно демонстрируют выраженную положительную динамику изменений функциональных параметров кожи у пациенток всех возрастных групп.

Проведенные клинико-лабораторные исследования позволили разработать протокол применения препарата Mesо-Xanthin F199 у пациентов различного возраста. Пациентам в возрасте от 40 до 50 лет рекомендовано проведение 4 процедур с интервалом 10–14 дней, от 50 до 60 лет необходим курс из 6 процедур с интервалом 7–10–14 дней,  от 60 лет и старше проводят 6 процедур с интервалом 7–10–14 дней + поддерживающий курс 1 раз в 6–8 недель.

У пациентов старших возрастных групп показана комплексная терапия в сочетании с препаратом Meso-Wharton P199 в соотношении 2 процедуры Mesо-Xanthin F199, 1 процедура Meso-Wharton P199. Повторный курс следует проводить через 6–12 месяцев.

 

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, мы выяснили, что исследованные нами препараты Meso-Xanthin F199 и фукоксантин способны, во-первых, активировать экспрессию гена GADD45A, а значит могут играть определенную роль в защите ДНК клетки от повреждения и, во-вторых, участвовать в эпигенетической активации регуляторных генов, усиливающих экспрессию интегринов и, вероятно, генов других белков, существенных для функциональной активности фибробластов. Действие обоих препаратов на экспрессию генов является избирательным: из полутора десятков исследованных нами генов, экспрессию изменяли лишь три (ITGB4, ITGA6, GADD45A). При этом мезоксантин и фукоксантин не только влияют на одни и те же гены, но и само это влияние качественно весьма сходно. Все это дает основание полагать, что именно фукоксантин является тем компонентом мезоксантина, который главным образом, если не исключительно, ответственен за описанные эффекты. Важно подчеркнуть, что избирательное действие на экспрессию генов является одной из ключевых характеристик эпигенетических механизмов.

Предварительные клинические испытания препарата Mesо-Xanthin F199 показали его высокую клиническую эффективность в профилактике и лечении возрастных изменений кожи, что было подтверждено данными УЗ-сканирования.

Благодарим А.В. Кузубова (НПК «Синтол») за предоставление праймеров.

 

ЛИТЕРАТУРА

1.Fisher GJ, Kang S, Varani J, et al. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Arch Dermatol, 2002;138:1462−1470.

2.Fisher GJ, Varani J, Voorhees JJ. Looking older. Fibroblast collapse and therapeutic implications. Arch Dermatol, 2008;144:666−672.

3.Baumann L. Skin ageing and its treatment. J Pathol, 2007;211:241–251.

4.Assaf H, Adly MA, Hussein MR. Aging and intrinsic aging: Pathogenesis and manifestations. In: Textbook of Aging Skin. Ed. by Farage MA, Miller KW, Maibach HI. − Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2010. P. 129−138.

5.Varani J, Dame MK, Rittie L, et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin. Roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Amer J Pathol, 2006;168:1861−1868.

6.Wang F, Garza LA, Kang S, et al. In vivo stimulation of de novo collagen production caused by cross-linked hyaluronic acid dermal filler injections in photodamaged human skin. Arch Dermatol, 2007;143:155−163.

7.Fraga MF, Esteller M. Epigenetics and aging: the targets and the marks. Trends in Genet, 2007;23:413−418.

8.Groenniger E, Weber B, Heil O, et al. Aging and chronic sun exposure cause distinct epigenetic changes in human skin. PloS Genet, 2010;6:e1000971. doi:10.1371/journal.pgen.1000971.

9.D’Orazio N, Gemello E, Gammone MA, et al. Fucoxantin: A Treasure from the Sea. Mar. Drugs 2012; 10:604-616.

10.Urikura I, Sugawara T, Hirata T. Protective effect of fucoxanthin against UVB-induced skin photoageing in hairless mice. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011; 75:757-760.

11.Tusnady GE, Simon I, Varadi A, Aranyi T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res, 2005;33(1):e9.

12.Aranyi T, Varadi A, Simon I, Tusnady GE. The BiSearch web server. BMC Bioinformatics, 2006;7:431.

13.Kligys KR, Wu Y, Hopkinson SB, et al. α6β4 integrin, a master regulator of expression of integrins in human keratinocytes. J Biol Chem, 2012; 87:17975–17984.

14.Barreto G, Schaefer A, Marhold J, et al. Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature, 2007;445:671−675.

15.Rai K, Huggins IJ, James SR, et al. DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and Gadd45. Cell, 2008;135:1201–1212.

16.Hollander MC, Fornace AJJr. Genomic instability, centrosome amplification, cell cycle checkpoints and Gadd45a. Oncogene, 2002;21:6228−6233.

17.Baylin SB, Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis. Epigenetics joins genetics. Trends in Genet, 2000;16:168−174.

18.Berdasco M, Esteller M. Aberrant epigenetic landscape in cancer: How cellular identity goes awry. Develop Cell, 2010;19:698−711.