Мeso-Wharton: исследование экспрессии сигнальных молекул под действием пептида P199

Статья напечатана в журнале «Les Nouvelles Esthetiques Украина» №3 (85) 2014 (Скачать)

 

Авторы:

Игорь КВЕТНОЙ — д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки, руководитель отдела патоморфологии ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН (Россия)

Ирина СМИРНОВА — д. м. н., профессор кафедры инфекционных болезней, эпидемиологии и дерматовенерологии Санкт-Петербургского государственного университета (Россия)

 

Процесс старения, конечно же, затрагивает все отделы и клетки кожи, в том числе стволовые. Возрастные изменения стволовых клеток могут включать снижение их мобилизации (нарушение сигнальных механизмов), а также снижение числа стволовых клеток, способных адекватно отвечать на стимулы. Перспективным направлением в создании препаратов для коррекции и профилактики возрастной инволюции кожи является разработка пептидов с различным механизмом действия, в том числе и таких, основной мишенью для которых являются стволовые клетки. В данной статье речь пойдет об одном из таких препаратов, предназначенных для интенсивной репарации кожи, о Meso-Wharton P199.

Состав препарата повторяет состав Вартонова студня пуповины, по аналогии с которым он и  был создан. Разработчики предполагают, что таким образом обеспечивается не только работа пептида P199, но и  воссоздаются эффекты микроокружения стволовых клеток.

 

НАУЧНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлась сравнительная комплексная оценка влияния пептида P199 и препарата Meso-Wharton P199 на экспрессию сигнальных молекул, являющихся маркерами процессов обновления эпидермиса и дермы, в культурах клеток с разным уровнем возрастной инволюции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на первичных культурах клеток – культуре кератиноцитов человека, содержащей преимущественно базальные клетки, и смешанной культуре фибробластов человека. Клетки взрослого человека выделяли из переднебоковой поверхности кожи лица, полученной в результате пластической операции.

Для каждой культуры были сформированы три группы:

— 1-я группа (контроль) – культура клеток, в которую вводился физиологический раствор;
— 2-я группа (опыт) – культура клеток, в  которую вводился пептид P199 в концентрации 15 нг/мл; — 3-я группа (опыт) – культура клеток, в которую вводился препарат Meso-Wharton P199 в количестве, обеспечивающем концентрацию изучаемого пептида 15 нг/мл.

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к ряду маркеров, характеризующих процессы обновления эпидермиса и дермы (табл. 1), и вторичные антитела – биотинилированные антимышиные иммуноглобулины (Novolink Polymerdetection system, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse, 1:40).

Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 8.0. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По данным проведенных исследований, пептид Р199 и препарат Meso-Wharton P199 оказывали стимулирующее действие на пролиферативную активность клеток кожи фибробластов и кератиноцитов. Этот эффект был более выражен в «зрелой» и «старой» культурах фибробластов и «молодой» культуре кератиноцитов.

Так, при культивировании фибробластов в присутствии Мезовартон пролиферативная активность клеток в «молодой» культуре увеличивалась в  1,2 раза (р = 0,007), в  культу- ре «зрелых» фибробластов – в 3,4 раза (р  =  0,000000) и в культуре «старых» клеток – в 2,2 раза (р = 0,006) по сравнению с контролем. Достоверные изменения показателя площади экспрессии маркера Ki67 при культивировании фибробластов в присутствии пептида Р199 были отмечены толь- ко в  культуре «зрелых» и «старых» клеток – в 2,2 и 1,5 раза (р = 0,000000 и р = 0,001) соответственно (табл. 2).

Добавление дозы препарата к кератиноцитам сопровождалось увеличением относительной площади экспрессии Кi67 в  3,4  раза в «молодой» культуре и в 2,8 раза в «зрелой» культуре (р =  0,000000). Эффекты пептида P199 были несколько менее выраженными: показатели площади экспрессии выросли в 2,1 и 1,6  раза (р = 0,000008, р = 0,0002) соответствен- но (табл. 3).

Экспрессия эндоглина (СD105), маркера стволовых клеток дермы, изменялась недостоверно как в присутствии препарата Meso-Wharton, так и  пептида P199. А вот показатели экспрессии р63 и β1-интегрина кератиноцитами существенно изменялись. Площадь экспрессии р63 в культуре «молодых» клеток при введении пептида P199 и препарата Мезовартон увеличивалась по  сравнению с  контролем в 2,1 и 3,1 раза соответственно (р   = 0,000000), а в культуре «зрелых» клеток – в 2,4 (р = 0,000005) и 1,3 раза (р = 0,009) соответственно (табл. 4).

По результатам проведенных исследований было установлено, что препарат и пептид P199 оказывали выраженное действие на синтетическую активность культивируемых фибробластов (табл. 5). Этот эффект был особенно значимым в культуре немолодых клеток. Причем стимулирующее воздействие препарата было более выраженным в культурах «зрелых» клеток, а Peptide P199 – в культуре «старых» клеток.

Так, в «молодой» культуре площадь экспрессии проколлагена I типа повышалась в присутствии Meso-Wharton в 3,9 раза, а пептида Р199 – в 2,8 раза по сравнению с контролем (р = 0,000000 и р = 0,000005 соответственно), в «зрелой» культуре – в 3,2 и  1,9 раза, а в культуре «старых» клеток в 16,4 и 22,65 раза (р = 0,000000, р = 0,000001) соответственно.

screenhunter_935-dec-23-16-52

screenhunter_936-dec-23-16-52

screenhunter_937-dec-23-16-52

ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного исследования был выявлен стимулирующий эффект, оказываемый пептидом P199 и инъекционным препаратом Meso-Wharton P199 на пролиферативную активность кератиноцитов и фибробластов в культуре, а также подтверждена синтетическая активность фибробластов. Эти данные можно трактовать в пользу предположения о том, что пептид P199 и препарат Meso-Wharton P199 стимулируют процессы обновления клеточных структур эпидермиса и дермы при нанесении на кожу и при внутрикожном введении инъекционным путем.

Стимулирующий эффект в отношении фибробластов был более выраженным в культуре «зрелых» и  «старых» клеток, что соотносится с клиническими данными о более высокой эффективности препарата у пациентов старших возрастных групп.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Giangreco A., Qin M., Pintar J. E., Watt F.  M. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging // Aging Cell. – 2008; 7 (2): 250–259.

2. Moore K. A., Lemischka I. R. Stem cells and their niches // Science. – 2006. 311: 1 880–1 885.

3. Sharpless N. E., DePinho R. A. How stem cells age and why this makes us grow old // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2007; 8: 703–713.

4. Weber C., Pohl S., Poertner R., Pino-Grace P., Wallrapp C., Geigle P., Czermak P. Bioreactor system for expansion and diff erentiation of human mesenchymal stem cells: design and scaleup strategy // GIT Bioprocessing. – 2009; 1: 9–13.

5. Zouboulis C. C., Adjaye J., Akamatsu H., MoeBehrens G., Niemann C. Human skin stem cells and the ageing process // Exp Gerontol. – 2008; 43 (11): 986–997.

6. Петриковский Б. Клеточное обновление возрастной кожи как результат пептид- ной регуляции собственных стволовых клеток // Эстетическая медицина. – 2012; XI (2): 283–293.