Клеточное обновление возрастной кожи как результат пептидной регуляции активности собственных стволовых клеток

ВВЕДЕНИЕ

Достижения в исследовании регуляции деления, созревания и жизнедеятельности клеток постоянно формируют новые знания о развитии процессов старения кожи и позволяют разрабатывать новые подходы и методы antiage терапии. Снижение скорости клеточного обновления кожи – ключевой момент в развитии процессов ее старения. В последние годы показано, что клеточное обновление и восстановление кожных покровов осуществляются за счет постоянно протекающих процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, расположенных на базальной мембране эпидермиса и по границе волосяных фолликулов [1]. Стволовые клетки (СК) базального эпидермиса поддерживают пул кератиноцитов [2], СК волосяного фолликула являются мультипотентными, способными дифференцироваться как в кератиноциты, так и в фибробласты и другие клетки дермы [3].
Основной функцией СК является физиологическая замена отслуживших дифференцированных клеток кожи и восстановление клеточного пула. Стволовые клетки можно назвать «машинами регенерации», но для их активации необходимы цитокины, факторы роста и другие сигнальные молекулы, синтез которых регулируется как стволовыми клетками, так и их микроокружением («нишей») [4]. Клеточное окружение – «ниша» – обеспечивает ключевые инструктивные сигналы для выбора «судьбы» клеток – сохранять идентичность стволовой клетке либо дифференцироваться в зрелые специализированные клетки.В стареющей коже вследствие клеточного обеднения и снижения синтетической активности клеток развивается «дефицит» цитокинов, ростовых факторов, сигнальных, регуляторных молекул. Количество синтезируемых клетками информационных сигнальных молекул становится недостаточным для активации пролиферации стволовых клеток. Стволовые клетки не работают, не активизируются и не пролиферируют без активного микроокружения, то есть без достаточного количества ростовых
факторов, цитокинов и сигнальных молекул.
Возникает необходимость внесения «внешнего» стартового сигнала, чтобы дать толчок к началу пролиферации СК и последующему клеточному обновлению.

 

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ИХ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

В процессе развития эмбриона человека происходит ряд ключевых событий: за оплодотворением яйцеклетки следует ее деление, суть которого сводится к быстрому накоплению тотипотентного (т.е. способного к созданию целого организма, повторению эмбриогенеза из одной клетки) клеточного материала.
Примерно после 12 клеточных делений этот процесс замедляется и нарушается синхронность делений. Начинается транскрипция генома зародыша, то есть реализация наследственной информации. Транскрипция завершается тем, что в цитоплазме этих уникальных первичных клеток накапливается информация в форме матричных РНК, которая определяет дальнейшее внутриутробное развитие.
Передача этой информации осуществляется в конечном итоге путем миграции, специализации клеток и формирования основных зародышевых листков – эктодермы (источника клеток кожи, ЦНС и др.), мезодермы (источника клеток мышц, костей, крови и др.) и энтодермы (источника клеток желез, ЖКТ и др.) [5]. Начиная с этого момента в каждой ткани сохраняются определенные запасы неспециализированных клеток. Это и есть стволовые клетки, или клетки-предшественники. Их основные функции – управление процессом «построения» организма в целом, перенос и реализация наследственных программ и восполнение по мере надобности клеточного состава. Определяющей чертой стволовых клеток является способность к самоподдержанию и самовосстановлению – генерации дочерних клеток, имеющих такие же регенеративные свойства, как и родительские клетки [6]. Во взрослом организме стволовые клетки присутствуют во всех органах и тканях. Важно, что откуда бы стволовые клетки ни пришли в место повреждения, под влиянием «микроокружения» они превращаются (дифференцируются) только в клетки того органа, в котором произошла «поломка» [4]. Опубликованы результаты исследований ученых Института Стоуэрса, работающих под руководством доктора Тинга Кси (Ting Xie), которые еще раз подтвердили важность «молодого» микроокружения для пролиферации стволовых клеток. Как полагает доктор Ting Xie, неэффективное замещение изношенных клеток взрослых тканей обусловлено снижением активности стволовых клеток, и это – первоочередная причина старения [7]. Снижение способности стволовых клеток к пролиферации – результат уменьшения синтеза биоактивных молекул. Научиться замедлять процесс старения путем определенных манипуляций над самими клетками или их микроокружением – значит открыть новые перспективы антивозрастной терапии.

 

СИНТЕТИЧЕСКИЙ ОЛИГОПЕПТИД SH-OLIGOPEPTIDE 72 /WHARTON JELLY PEPTIDE P199 – КЛЮЧ К АУТОРЕПАРАЦИИ КОЖИ 

При проведении внутриутробных операций на плоде в отделении акушерства и гинекологии Центрального госпиталя Нью-Йорка (NY Downtown Hospital) было отмечено, что заживление тканей у плода всегда протекает эффективно и без образования рубца. Было высказано предположение, что такой процесс заживления обусловлен высокой пролиферативной активностью эмбриональных стволовых клеток в желеобразной эмбриональной субстанции пупочного канатика, называемой Wharton’s Jelly.
Коллективом ученых медицинского центра университета Нассау (Nassau University Medical Center, Long Island, NY) был исследован состав Wharton’s Jelly. В ходе этого исследования было выяснено, что желеобразная эмбриональная субстанция пупочного канатика является источником эмбриональных стволовых клеток, пептидов, сигнальных молекул, факторов роста, фосфолипидов, энзимов, гликозаминогликанов, среди которых был, в частности, выделен полипептид, стимулирующий деление стволовых клеток. Синтетический аналог этого пептида, разработанный специалистами американской компании ABG Lab LLC, получил название sh-Oligopeptide 72 /Wharton’s Jelly Peptide P199 (сокращенно пептид P199). Пептид P199 состоит из 72 аминокислот и имеет молекулярную массу 8,4 кДа. Мишенью для его воздействия являются стволовые клетки кожи, по отношению к которым Wharton’s Jelly Peptide P199 действует как сигальный фактор, активирующий их пролиферативные свойства. В США и России были проведены исследования действия пептида Wharton Jelly Peptide P199 на синтез сигнальных молекул, необходимых для активации пролиферации стволовых клеток кожи. Эти исследования включали:
– исследование динамики экспрессии генов ростовых факторов и генов внутриклеточных мессенджеров активации клеток, а также изучение содержания цитокинов и ростовых факторов в культуре клеток кожи человека до и после внесения в нее пептида P199. Целью этого исследования было изучение механизмов воздействия пептида P199 на культуру клеток кожи, которое можно рассматривать как прямое отражение его воздействия на целостную ткань кожи человека;
– исследование изменения содержания стволовых и транзиторных клеток у новорожденных белых мышей при нанесении на их кожу крема с пептидом P199. В ходе исследования определяли уровень экспрессии мембранных маркеров стволовых клеток. Увеличение экспрессии этих маркеров служило доказательством увеличения количества стволовых и транзиторных клеток;
– исследование экспрессии маркеров стволовых и транзиторных клеток в биоптатах кожи человека под воздействием пептида P199.

 

А. Исследование действия пептида Р199 в культуре клеток кожи человека 

 

Материалы и методы

В культуре клеток кожи человека содержатся кератиноциты, фибробласты, мононуклеары, лейкоциты, клетки Лангерганса, иммунные клетки, тучные клетки и др. Клетки кожи выделяли из кожи взрослых доноров по методу Рейнвальда [8] модифицированному Юдинцевой и соавт. [9]. В качестве источника
клеток использовали кожу лица, полученную в ходе пластических операций.
При постановке экспериментов использовали культуру клеток кожи с плотностью клеток 1х105/мл среды. До внесения пептида P199 в культуре измеряли базальный уровень экспрессии генов ростовых факторов и генов внутриклеточных мессенджеров активации клеток, а также базальный уровень цитокинов и ростовых факторов (по 15 измерений каждого параметра).
После этого вносили пептид P199 в концентрации 20 нг/мл. Через 4 часа измеряли уровень экспрессии генов ростовых факторов и генов внутриклеточных мессенджеров активации клеток. А через 8 часов измеряли содержание цитокинов и ростовых факторов (по 15 измерений каждого фактора). В контроле культура клеток кожи инкубировалась с человеческим сывороточным альбумином и измерялся уровень тех же интересующих факторов (по 15 измерений каждого фактора).
Для измерения уровня экспрессии генов применяли PCR-метод с использованием собственных праймеров и реагентов фирмы БиоКом. Для количественного измерения факторов роста и цитокинов использовали коммерческие тест-системы ELIZA и наборы моноклональных антител производства
фирмы Biosource (Бельгия).

 

Результаты

Результаты измерений представлены на диаграммах (рис. 1–4). Динамика экспрессии генов измерена в условных единицах, базовый уровень принят за 1. Из приведенных диаграмм видно, что под воздействием пептида P199 в культуре клеток кожи человека происходит статистически достоверное увеличение экспрессии генов ростовых факторов. Эта серия диаграмм показывает, что пептид P199 достоверно увеличивает в культуре клеток кожи человека количество цитокинов и ростовых факторов, создавая тем самым тот самый «каскад» сигнальных молекул, который необходим для активации процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.

screenhunter_860-nov-30-16-03

Рис. 1. Динамика экспрессии генов, кодирующих белки, передающие клетке сигнал, стимулирующий ее к пролиферации, под влиянием пептида Р199: EGF-R-гена (гена рецептора эпидермального фактора роста) (а); cRAS-гена (гена белка – цитоплазматического передатчика сигнала) (б); c-SRC-гена (гена тирозинкиназы) (в); cMYC-гена (гена ядерного транскрипционного фактора) (г)

screenhunter_861-nov-30-16-05

Рис. 2. Динамика экспрессии генов факторов роста под влиянием пептида Р199: генов фактора роста кератиноцитов (а); генов эпидермального фактора роста (б); генов фактора роста фибробластов (в); генов эндотелиального фактора роста (г)

screenhunter_862-nov-30-16-06

Рис. 3. Средние количества цитокинов в культуре клеток с добавлением пептида P199: ИЛ-1 (а); ИЛ-3 (б); Л-6(в); ИЛ-8 (г)

screenhunter_863-nov-30-16-07

Рис. 4. Средние количества ростовых факторов в культуре клеток с добавлением пептида P199: фактора роста кератиноцитов (а); эпидермального фактора роста (б); фактора роста фибробластов (в); эндотелиального фактора роста (г). Все ростовые факторы (кроме эндотелиального) измерены в пикограммах, эндотелиальный фактор роста измерен в нанограммах.

 

Изучение действия пептида P199 на пролиферативный потенциал стволовых клеток кожи мышей 

 

Материалы и методы

Работа проводилась на мышах линии BALB/C в возрасте 5 дней в течение 5 недель. Были сформированы 2 группы мышей: контрольная и опытная (по 10 особей в каждой группе). На спину мышей опытной группы в районе крестца наносили крем с пептидом P199 (концентрация пептида в креме – 100 нг/ мл) в количестве 0,3 мл один раз в день в течение 5 недель. В контрольной группе на спину мышей в районе крестца в течение 5 недель также наносили крем, но состоящий только из базовой основы, – по 0,3 мл один раз в день. По истечении 5 недель всех животных обе зболивали для взятия биоптата. Биоптат кожи спины размером 0,5 см в диаметре брали в районе нанесения крема. Полученный эпидермальный срез помещали в пробирку, содержащую необходимую питательную среду, и инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре. Отмывали, добавляли стабилизаторы и необходимые ферменты и разделяли эпидермальный срез на изолированные клетки кожи. После этого клетки были ресуспендированы в 0,1 мл питательной среды с добавлением веществ, препятствующих агрегации клеток и способствующих сохранению клеточной суспензии. После получения клеточной суспензии клетки «окрашивали» для выявления специальных маркеров стволовых клеток и изучали под микроскопом. Оценивали отношение количества стволовых клеток к количеству всех остальных клеток в суспензии. Подсчет клеток и анализ результатов проводили путем флюоресцентной микроскопии на микроскопе фирмы Opton (Германия). Для исследования использовали стандартную панель на базе моноклональных антител производства фирмы Chemicon (Chemicon International, США): tage-Specific Embryonic Antigen-3 (SSEA-3), Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4), TRA-1-60. Антитела SSEA-3 и SSEA-4 – липидные антигены, представляющие собой комплекс гликолипида GL7 с сиаловой кислотой, а TRA-1-60 – высокополимерный гликопротеид. Эти антитела взаимодействуют со специфическими антигенами, находящимися на наружной поверхности мембраны стволовых клеток, и тем самым позволяют выявить стволовые клетки, а также определить их количество. Увеличение процентного содержания маркеров стволовых клеток свидетельствует об увеличении содержания стволовых клеток в эпидермисе.

 

Результаты

В результате флюоресцентно-микроскопического анализа обнаружена разница в содержании стволовых клеток в клеточных суспензиях, полученных от мышей опытной и контрольной групп. В клеточных суспензиях, полученных от крыс опытной группы, количество стволовых клеток было достоверно выше, чем в образцах, полученных от крыс контрольной группы (табл. 1, рис. 5).

810bf7baa1781973d60816bad812d771

Рис. 5. Среднее содержание маркеров стволовых клеток в опытных (с добавлением пептида Р199) и контрольных образцах

Так, в опытных образцах среднее содержание маркеров стволовых клеток составило: в SSEA-3 – 3,52%; в SSEA-4 – 4,16%; в TRA-1-60 – 2,99%, а в контрольных соответственно 0,81, 0,72 и 0,61%.
Данная диаграмма показывает, что пептид P199 способствует пролиферации и увеличению количества стволовых клеток. Это подтверждается увеличением содержания маркеров стволовых клеток в биоптатах, взятых у мышей после 5-недельного применения крема с этим олигопептидом.

Таким образом, можно утверждать, что пептид Р199 способствует синтезу биологически активных молекул в самых разных клетках кожи – кератиноцитах, фибробластах, моноцитах, иммунных клетках. Все вместе они создают тот «каскад» цитокинов, ростовых факторов и сигнальных молекул, который активирует пролиферацию стволовых клеток. Следовательно, пептид Р199 действует по отношению к стволовым клеткам кожи как сигнальный фактор.

85ae7159021f2944e209f413aaabb6e9

 

Исследование экспрессии маркеров, специфичных к стволовым и транзиторнымклеткам, в биоптатах кожи человека под воздействием пептида Р199 

 

Материалы и методы

Целью иммуногистохимического исследования было определение влияния пептида Р199 на активность и пролиферативную способность стволовых клеток в биоптатах кожи человека. Количество эпидермальных стволовых и транзиторных клеток подсчитывалось на основании экспрессии маркеров: β1-интегрина, цитокератина-15, цитокератина-19.Исследование проводили на биоптатах кожи человека, полученных после круговых подтяжек кожи лица у 15 волонтеров в возрасте 35–45 лет. Полученные биоптаты кожи промывали раствором Хенкса с добавлением гентамицина. Избыток подкожной жировой ткани удаляли. Кожу разрезали на кусочки размером 1х1см, которые затем использовали для приготовления контрольных и опытных образцов.
Для опытных образцов кусочки кожи инкубировали в культуральной питательной среде DMEM с добавлением пептида Р199. Полное время инкубирования составляло 2 дня, питательная среда заменялась через 24 часа. Концентрация пептида Р199 в среде во время инкубирования составляла 15 нг/мл (0,3 мл Р199 добавляли к 2 мл питательной среды). В качестве контрольных образцов использовали кусочки кожи, инкубированные в DMEM-среде с добавлением раствора альбумина.
После культивации кусочки кожи отмывали фосфатным буфером, делали криосрезы толщиной 5 мк и проводили «окрашивание» клеток для проведения иммуногистохимических исследований.
Для идентификации стволовых и транзиторных клеток использовали общепринятые для эпидермальных стволовых клеток чело века маркеры: β1-интегрин, цитокератин-15, цитокератин-19 [10–12]. Выявление маркеров стволовых клеток и количественная их оценка осуществлялись с помощью флюоресцентной микроскопии. Для визуализации клеток, положительных к маркерам, были использованы универсальные флюоресцентные антитела. Исследования были выполнены на флюоресцентном микроскопе Leica DM 4000. Количественная оценка стволовых и транзиторных клеток проводилась в области волосяных фолликул.

 

Результаты

Результаты флюоресцентно-микроскопического анализа приведены на рисунках 6–11. Полученные данные свидетельствуют о достоверном (в 3,5 раза) повышении количества цитокератин-15-позитивных клеток после инкубирования образца кожи в питательной среде с добавлением пептида Р199. Выявлено достоверное (в 2,4 раза) повышение количества цитокератин-19-позитивных клеток в образце кожи человека после инкубирования его в течение 2 дней в культуральной среде с добавлением пептида Р199.

1bcabce50199d0e1ac6531bc8dfb3d3f

64e81f1c9baa9a78fb938c0d07f976ee

243055c677a063a5bf6904200d0edec9

355e470b164a0373583285d7e29682ef

f0c90a140c66e3616caa45a583a1dbdd

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

Выполненные исследования подтверждают высокую биологическую активность Wharton Jelly Peptide P199, эффективно способствующего пролиферации эпидермальных стволовых клеток человека и соответственно ауторе-парации кожи. Благодаря своим уникальным свойствам полипептид P199 стал главным компонентом инъекционного биорепаранта нового поколения «Meso-Wharton P199™».

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Winter MC, Bickenbach JR. Aging epidermis is maintained by changes in transit-amplifying cell kinetics, not stem cell kinetics. J Invest Dermatol, 2009;129(11):2541–2543.
2. Giangreco A, Qin M. еt al. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging. Aging Cell. 2008;7(2):250–259.
3. Jahoda CB, Reynolds AJ. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet, 2001;358(9291):1445–148.
4. Терских ВВ, Васильев АВ, Воротеляк ЕА. Ниши стволовых клеток. Изв РАН. Сер биол, 2007;(3):261–272.
5. Itskovitz-Eldor J, Schuldiner M, Karsenti D, еt al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med, 2000;6(2):88–95.
6. Blanpain C, Fuchs E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009;10(3):207–217.
7. Mimeault M, Batra SK. Recent advances on skinresident stem/progenitor cell functions in skin regeneration, aging and cancers and novel anti-aging and cancer therapies. J Cell Mol Ved, 2010;14(1–2):116–134.
8. Rheinwald JG. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth Cell Biol, 1980;21A:229–254.
9. Юдинцева НМ, Горелик ЮВ и др. Трансплантация аллогенных эпителиальных пластов на ожоговые
раны. Цитология, 1999;41(3/4):328.
10. Lyle S, Christofidou-Solomidou M, et al. Fhe C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J Cell Sci, 1998;111(Pt 21):3179–3188.
11. Michel M, Török N, et al. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites and their number varies with donor age and culture stage. Germain L J Cell Sci, 1996;109(Pt 5):1017– 1028.
12. Ma DR, Yang EN, Lee ST. A review: the location, molecular characterization and multipotency of hair follicle epidermal stem cells. Ann Acad Med Singapore, 2004;33(6):784–788.