Исследование влияния Meso-Wharton P199™ — На репарацию после лазерного воздействия

НОВОСТИ ЭСТЕТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ №3(97) 2016 (скачать статью из журнала)

 

Автор: Сергей МОРОЗОВ — д.м.н., профессор, член- корреспондент РАН, заместитель директора по науке ФГБУ «НИИОПП» РАН (Россия)

Альтернативной моделью органотипических культур эксплантатов тканей человека для исследований могут служить клеточные сфероиды, получаемые при культивировании в неадгезивных условиях из суспензии одиночных клеток. В таких экспериментальных моделях для исследований клетки устанавливают не только между собой межклеточные контакты, но и синтезируют внеклеточный матрикс, в результате чего образуется структура, организация которой приближена к организации ткани in vivo. Диаметр используемых в исследовании сфероидов не превышает 200 мкм, что обеспечивает нормальную диффузию питательных веществ в центральную зону. Кроме того, клеточная адгезия при формировании сфероидов происходит за счет связывания клеток с внеклеточным матриксом через белки интегрины. Такое строение адгезионных контактов позволяет клеткам в сфероиде кооперативно реагировать на механические сигналы и, следовательно, разного рода повреждения аналогично процессам, которые происходят при повреждениях в тканях.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для изучения воздействия Wharton Jelly Peptide P199, главного ингредиента инъекционного препарата медицинского назначения Meso-Wharton Р199, ABG lab (США), на репарацию после повреждения монослойные клеточные культуры фибробластов (Р18) культивировали с добавлением в ростовую среду пептида, растворенного в солевом буфере и смешанного с полной ростовой средой в соотношении 1:10, в  течение 72 часов. Для получения сфероидов часть клеток культивировали в присутствии пептида Р199 в  той же концентрации (1:10) в течение 7 суток при стандартных условиях (+37 °С, 5% СО2 ). Каждые 72 часа проводили замену полной ростовой среды свежей с  добавлением пептида Р199. Через 7 суток сформированные сфероиды имели диаметр 100–150  мкм. Для создания видимого повреждения использовали микродиссектор на основе наносекундного лазера (длина волны – 355 нм, частота импульсов  – 100 Гц, длительность импульсов – 2 нс, максимальная энергия в импульсе   – 9  мкДж). Путем воздействия наносекундных лазерных импульсов осуществляли повреждение поверхностных и  внутренних слоев сфероида. После повреждения часть сфероидов продолжили культивировать в полной ростовой среде, смешанной с растворенным в солевом буфере пептидом Р199 в соотношении 1:10, другую часть поврежденных сфероидов культивировали в полной ростовой среде, но без добавления пептида. Все это время велось прижизненное наблюдение. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 минут с  помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили с  помощью программного пакета Cell-IQ Analyzer.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сразу после повреждения наблюдали спонтанное раскрытие краев раны. Угол раскрытия раневой области в течение первого часа увеличивался, рана «раскрывалась». В области повреждения уже через 30 минут после воздействия лазером внутренняя поверхность раны содержала фрагменты погибших клеток. В поврежденной области нарушалась исходная структура сфероида. Выжившие клетки меняли форму на округлую. В неповрежденной части поверхностного слоя сфероидов сохранялась компактная структура и  уплощенная форма клеток. Через 1 час после повреждающего воздействия в сфероидах, культивированных с добавлением пептида Р199, фрагменты разрушенных клеток исключались из сфероида. Клетки на границе поврежденной области округлялись (рис.  1).

screenhunter_850-nov-30-12-40

В сфероидах, культивированных без пептида Р199, повреждение сильнее разрушало сфероиды, раскрытие раны было максимальным, практически полностью нарушался поверхностный слой по всему периметру сфероида (рис. 2).

screenhunter_851-nov-30-12-40

В ходе прижизненного наблюдения за сфероидами с использованием цейтраферной (time-lapse) микроскопии в течение 7 суток после действия лазера было обнаружено следующее (рис. 3).

screenhunter_852-nov-30-12-40

Через 12 часов в сфероидах с добавлением Р199 края раневой поверхности замыкались, начиналось восстановление структуры сфероида, но поверхностные клетки оставались округлыми. К третьим суткам структура сфероида частично восстанавливалась, клетки в поверхностной зоне снова приобретали уплощенную форму. Вокруг восстанавливающегося сфероида наблюдалась небольшая «шубка» из погибших при повреждении клеток. Через 7 суток наблюдали полное восстановление исходной структуры сфероидов, восстанавливалась нативная структура сфероидов с эпителизованным поверхностным слоем. В сфероидах, культивированных без пептида Р199, восстановления и эпителизации сфероидов не наблюдалось даже через 7 суток культивирования.

 

ВЫВОДЫ

Лазерное повреждение сфероидов является адекватной моделью для исследований по влиянию препаратов на эффективность заживления раны. Исследование воздействия Wharton Jelly Peptide P199, главного ингредиента инъекционного препарата медицинского назначения Meso-Wharton Р199, ABG lab (США), на репарацию после повреждения позволило проанализировать механизм действия пептида и показать эффективность применения пептида для безрубцового заживления.